《WBwesternblot试验常见问题解答文档》由会员分享，可在线阅读，更多相关《WBwesternblot试验常见问题解答文档（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1 各位朋友：请教关于SDS-PAGE的问题。我的配胶体系如下：15%分离胶 4%浓缩胶水 2.3ml 2.7ml30%丙烯酰胺 5.0ml 0.67mlTris-HCL PH8.8 2.5ml PH6.8 0.5ml10%SDS 0.1ml 0.04ml10%APS 0.1ml 0.04ml TEMED 0.004ml 0.004ml 我的蛋白分子量是11kd，浓缩胶60V,40min，分离胶90V，70min。跑胶时总是跑不直，呈抛物线型，请问是什么原因？我的试剂都是新配置的。谢谢！答：【1】胶的配制方法；配制不同体积15%胶 SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升) 15%胶 (毫
2、升) ： 5 10 15 20 30 50 蒸馏水 ： 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 5.0 30%Acr-Bis(29:1)： 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 25.0 1M Tris, pH8.8： 1.9 3.8 5.7 7.6 11.4 19.0 10%SDS ：0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 10%过硫酸铵： 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.5 TEMED： 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02 配制不同体积4%胶 SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升) 4浓缩胶（两块胶，5ml）超纯水
3、 ： 3.16ml40Acr/Bic（37.5：1） ： 0.5ml0.5 mol/L TrisHCl（pH6.8） ： 1.26ml10SDS ： 50 微升m微升m10%AP（过硫酸胺） ： 25 TEMED ： 5 微升m加TEMED后，立即混匀即可灌胶。【2】注意玻璃板一定要洗干净，这一点比较重要。如果玻璃板洗不干净，很容易造成楼主所说的现象。【3】注意电泳液不要出问题（是否过期了，是否把转移液当成电泳液了？），电泳液如果出问题，也会造成楼主所说的现象。2 pvdf膜到底能不能用丽春红染色来查看蛋白是否转上去 ？我转过很多次了，都没有看到过丽春红显色。但是有看到有人说能染上，是在是不知
4、道，请教给位大大了答：【1】PVDF膜肯定可以用丽春红染色的。我们这里的很多人基本上用 的都是PVDF膜，染膜用的都是丽春红。大多数时候都能染出条带的。【2】下面是丽春红的配方：10X丽春红染液丽春红S 2g三氯乙酸 30g磺基水杨酸 30g蒸馏水至 100ml使用时将其稀释10倍。当然现在有很多公司直接卖配好的丽春红，因为其可以回收重复利用，所以可以买配好的丽春红。下面是一份丽春红的说明书：1.将PVDF膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜浸没在丽春红染色液中，摇动3-5分钟或更长时间，直至出现清晰条带。对结果作适当 记录。 2.用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗2-3次，每次3-5分钟，去除丽春
5、红，进行后续的Western检测。 从使用说明中，我们可以看出，PVDF膜是可以用丽春红染色的。【3】我的染色方法是：转膜完成后，取出膜在甲醇里泡1分钟，然后在双蒸水中过一下，放入丽春红里染色，室温，摇床上，时间是530分钟。然后把染好的膜放到双蒸水中洗一下，不要洗的太久，把表面的丽春红洗掉就可以了。这时就可以看到红色的蛋白条带了。然后把膜放在TBST中，室温，摇床上洗3次，每次10分钟。然后就可以往下做了。【4】丽春红的染色敏感性和ECL敏感性差的很远呢。也就是说，及时丽春红染色染不出来，ECL 也有可能曝光曝出来的。【5】感觉丽春红染色效果不是很好的，有时候清楚，有时候也不是很清楚。而且染
6、色后再往下做后面的结果会收到一定的影响。所以，如果熟练了，后面就可以不染色了。也可以上样的时候都上两个孔的样，转膜后把这两个孔对应的膜剪下来染色，如果染上了，说明其他的也会染上的。3 我做WB，曾跑出过条带，就是有非特异性条带，准备摸一抗和二抗浓度，但后来就什么条带都显不出来了，就算换成有条带时的浓度，条件也没变，就是做不出来，转膜后膜上能清晰看见预染的彩虹marker，但用丽春红染膜，却没明显的蛋白条带，就能看见泳道，请教实验室其它人，就说是我转膜弥散，求助个位大侠，我该怎么做？说说我的wb条件：蛋白大小：50kd5积层胶，10分离胶电泳先100v，后180v转膜条件：冰水中恒压100v 1
7、h 湿转（在转时电流在200400ma变，先小，后大，还有就是转移缓冲液在转时会冒好多泡泡），我用的是NC膜，滤纸两边个四层答：【1】转膜的时候最好用衡流，试一下380毫安，半小时。转移液注意最好现配先用，不要用很多次，这很重要，我一般应用不超过两次。【2】转膜的时候，夹胶和膜的夹子的松紧要适中，可以通过调节滤纸的张数来控制夹子的松紧。【3】电泳的电压太大，减小电泳的电压。可以先用80伏20分钟，然后120伏。也可以一直用80伏。也可以先用60伏，然后80伏。【4】可以适当增加曝光时间试一下。4目的蛋白不表达。的leilaliu wrote:这是我的操作步骤：取0.1g 组织，加1ml裂解液（
8、1 mol/l tris.hcl 2.5ml ,NaCl 0.438g, TritonX-100 0.5ml, 蒸馏水至50ml，使用时加了100ug/ml的PMSF)，机械匀浆2分钟，冰上裂解30分钟，然后14000g 10分钟离心，取上清液。取20ug上样量，然后80V浓缩胶，130V分离胶，然后80V，180mA转膜2个小时，然后5%封闭一个小时，室温。然后一抗1：500（5%脱脂奶粉加TBST里面）孵育一个晚上，TBST清洗3次，每次10分钟。然后二抗1：2000处理方式同一抗，孵育时间为1个小时，室温，TBST清洗3次，每次10分钟。再用ECL 处理等等。但是，我的目的蛋白：CaMK
9、IIa总是做不出来。狂哭。分子量是50KD。答：【1】上样量一般是20100微克，你的上样量是20微克，你的条带很弱或者出不来，为什么不加大上样量呢？可以加到100微克左右呀（这点其实挺重要的）。【2】你说：“80V，180mA转膜2个小时”。一般转膜的时候只能衡流或者衡压吧，怎么你的电流电压都是恒定的呢？转膜感觉还是衡流好。我一般用380毫安湿转30分钟。当然转膜很多条件都是可以的。【3】一抗孵育最好在摇床上，一抗孵育后，TBST清洗3次，每次5分钟就可以了。【4】可以适当增加曝光时间。蛋白不的蛋【】【打飞人头儿就可突破5 各位好，我现在遇到的问题是，立春红显色后效果很好（师姐和实验老师都这
10、么认为），虽然不知道蛋白条带（45KD）的具体位置，但是比对Marker还是可以感觉到那部分的条带很清晰的。但是我始终做不出结果，现把步棸详解如下，希望大家帮我分析一下：1，封闭（5的脱脂奶粉）一小时，室温下摇床上进行。2，TBS/T洗膜3次，每次5分钟。用滤纸去尽残液。3，孵育一抗（cell signaling，单克隆抗体），比例是1:1000(说明书上标示)。先室温摇床上1小时，再放在4度冰箱过夜。4，TBS/T洗膜3次，每次5分钟。用滤纸去尽残液。5，孵育二抗（博士德），比例是1：5000（我用的说明书上的最大标示）。室温摇床2小时。6，TBS/T洗膜3次，每次5分钟。用滤纸去尽残液。7
11、，加入pierce显色试剂（按说明书要求进行）。8，曝光5分钟，显影（至今为出现目的条带），定影。（把膜拿到暗室观察什么都没有，只有一些荧光液的残留痕迹，成隐约大片状，多出现于膜的边缘处，绝对不成条带状。）答：【1】细节决定成败！【2】你说你的显色液都是荧光了。我估计你每次做完了，显色用的器具都不洗吧？其实很多人都不在意，这点其实很重要的，就是凡是和膜接触的东西都要干净，要洗的很干净，当然夹膜用的镊子更是要干净。【3】整个显色曝光都应该在暗室里呀。你放外面显色干什么呀？这是一个连续的过程，没必要分开吧，感觉分开反而跟浪费时间呀。【4】具体问题具体分析。显色的时间不是固定的，如果膜放到显色液里，
12、荧光很强，迅速拿出，放到保鲜膜上，然后曝光就可以了。如果膜放到显色液里，荧光很弱，可以多放一会，其实不用放很长时间也是可以的。可以把膜放到保鲜膜上，因为保鲜膜上会粘有显色液的，在保鲜膜上照样可以进行显色反应的。如果膜很亮（就是说荧光很强），曝光时间可以很短的，如果荧光很弱或者看不到荧光，可以曝光很长时间的。如果荧光很强，我会曝光最短的时间，也就是说，把曝光盒（压片暗盒）盖上然后用最快的速度打开就可以了，如果荧光弱的话，我就用黑塑料袋把曝光盒装起来然后放入抽屉，去吃饭或者干其他事情，回来继续显影定影，条带照样很清楚的，哈，有时候那是相当的清楚。【5】我把你的步骤改了一下。供参考。1，封闭（5的脱
13、脂奶粉）4小时，室温下摇床上进行。（说明：封闭是很重要的一步，这步应该多话时间。一般来说，2小时也可以的，但是1小时有些短了）。2。此步删掉。3，孵育一抗（cell signaling，单克隆抗体），一抗用5的脱脂奶粉稀释，比例是1:1000(说明书上标示)。放在4度冰箱过夜。（一抗孵育不是时间越长越好，应该适度，如果越长越好，那直接在室温或者在37度放一夜不是更好。一抗用5的脱脂奶粉稀释效果远好于用TBST等稀释，这是我的亲身经历。封闭过后不用洗脱。）4，TBS/T洗膜3次，每次5分钟，摇床上。（可以不用滤纸吸，直接放入二抗孵育）。5，孵育二抗（博士德），比例是1：5000（我用的说明书上的
14、最大标示）。室温摇床1小时（二抗1小时足够了）。6，TBS/T洗膜3次，每次10分钟。（可以不用滤纸吸）。7，加入pierce显色试剂（按说明书要求进行）。8，曝光5分钟（曝光时间可以按实际情况的不同而不同），显影（至今为出现目的条带），定影。（把膜拿到暗室观察什么都没有，只有一些荧光液的残留痕迹，成隐约大片状，多出现于膜的边缘处，绝对不成条带状。）6 本人在做一个18KD蛋白的wb，转膜后预染marker各个条带都可见，不知道就是目的条带都不能曝光出来。内参的B-actin条带清晰，背景也没有。想请教各位大侠：1.胞浆蛋白的提取是不是有什么特殊要求。有什么提取方法比较好！2.18kd蛋白的转
15、膜甲醇的浓度是不是要比较高。3.其他。希望能够有好的回答，最好能提供好的参考文献。谢谢！答：【1】你转膜后预染marker各个条带都可见，说明转膜没有问题。【2】感觉还是用试剂盒好一些。【3】可以适当减少电泳的时间。【4】测过蛋白浓度吗？蛋白浓度是多少呀？如果蛋白浓度不是很高，上样量不是很大的话，可以增加上样量，增加蛋白浓度。【5】增加一抗浓度，增加一抗孵育时间。【6】增加显色时间。【7】增加曝光时间，可以曝光很长时间的。【8】当然是0.2m的膜好一些，但是18KD的蛋白用0.45的膜也可以的。注意转膜时间不要太长。7请问有人做过19KD的蛋白吗？已经做了一段时间了，可是还是没有什么起色啊。现在跑胶倒是已经可以了。但是转膜后染色看不到我要的条带啊。那条带在胶上就是很淡的，但是基本能看到。可是转膜后就真的什么都看不到了似的。有没有什么办法可以成功将量少的蛋白条带转膜啊（可以肯定的说我的转膜条件没有将我所需要的条带转过）。谢谢
