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1、摘要：细胞工程是四大生物工程之一，细胞融合技术作为细胞工程的一项心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的探讨成果，而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上，另一方面体现在新方法上，再者体现在融合对象的不断扩展上。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用，使细胞融合的方法和手段向操作更为简便，便于量化探讨，同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。关键词： 方法 动物细胞融合 植物细胞融合 应用1.细胞融合常用的技术1.1生物法 仙台病毒HVJ诱导法 1962年日本的冈田善雄偶然发觉了由日本血凝性病毒HVJ或称仙台病毒引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核
2、细胞的现象+ 冈田善雄的探讨为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础, 细胞融合现象的发觉引起细胞学界的高度重视。 1.2化学法盐类融合法 此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后探讨应提高其融合率,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。高钙和高pH值融合法 Keller首先发觉高Ca2+和高pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合胜利并获得100余株体细胞杂种。提高该方法的运用范围是亟待解决的问题。聚乙二醇融合法(PEG法) 加拿大籍华人高国楠(1974)用聚乙二醇(PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌
3、豆的融合5。此法比病毒更易制备和限制,活性稳定,用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%55%)对细胞的毒性应进一步减小。1.3物理法电脉冲诱导细胞融合技术电脉冲诱导细胞融合技术,产生于20世纪80年头,目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高,是PEG的100倍,操作简便、快速,对细胞无毒无害,可在显微镜下视察融合全过程6。激光融合技术 1987和1989年德国海德堡理化探讨所采纳准分子激光器使油菜原生质体融合,从起先照耀到完成融合仅需几秒钟7。该法可选择随意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时定位性强,损伤小
4、,参数易于限制,操作便利,可利用监控器清晰地视察整个融合过程,试验重复性好,无菌无毒性,但它只能逐一处理细胞。2细胞融合技术的最新进展2.1基于微流控芯片的细胞融合技术随着微机电系统mems技术和微加工技术的发展，微电极阵列的设计加工制作也日趋成熟，加之微通道网络可以整合到生物芯片之上，这将使得微流控系统成为细胞融合的志向平台，利用微流控系统可以根据预定的要求大量融合异种细胞.目前，基于微流控芯片的细胞融合技术已成为细胞融合技术探讨的重点领域。优点：基于芯片技术的微流控系统不仅可以实现对细胞甚至单个细胞的操控，比如转移、定位、变形等，也可以同时输送、合并、分别和分选大量细胞，细胞融合在芯片上可
5、以通过并行或快速排队的方式实现.缺点：由于在微通道内的腔体容积很小，所以会大幅削减细胞融合中所需的细胞数量，同时细胞融合率和杂合细胞的成活率会大大提高.2.2高通量细胞融合芯片高通量细胞融合芯片利用微电极阵列在微米范围内（040um）产生的高强度、高梯度辐射电场，使得细胞在特殊辐射电场的作用下产生介电质电泳力，精确处理和刺激预定的目标细胞，从而使目标细胞根据预先设计的方向（可以是任何预先设计好的方向）以预定的速度（可以是不同种的细胞以不同的速度定向）移动，从而根据设计要求精确地、大批量地得到目标细胞配型，集成微电极阵列的微流控系统，可以便利敏捷地实现对细胞的操作、隔离和转移.由于在微通道内微电
6、极间距可以做得很小，因此获得同样强度的辐射电场强度只需施加较低电压的交变电场和脉冲即可，不用加载昂贵的高电压发生装置例如, 在20um 的电极对间距施加14 V的脉冲就相应地可以获得7 kV/cm 的高强度场强, 这足以形成细胞融合所须要的电场强度。高通量细胞融合芯片可以与化学诱导融合、电诱导融合等方法相互结合，比如：在细胞融合缓冲液中加入少量的peg可大大提高细胞的融合率.此外，二价阳离子以与蛋白酶对细胞进行预处理，融合率也可大幅提高$ 然而，截至目前各国与此相关的细胞融合试验工作只有几篇文章见诸报端，很多构想也只是在理论层次上的探讨$2.3空间细胞融合技术由于地球引力的存在，有液泡的原生质
7、体与无液泡的原生质体的密度差加大，异源细胞间的融合得率非常有限. 在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中，由于无法解除地球引力的影响，要提高淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难世纪9 年头以来，人们在空间材料科学的启发下，试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术.大量的飞行试验结果表明，在微重力条件下酵母细胞的融合得率有很大的增加，融合得率增加主要是由于降低了重力沉降影响，而杂种细胞的活力增加可能是由细胞排列时间缩短引起的.在取得这些胜利试验的基础上，进一步探讨融合后的细胞在空间培育的可能性已经具备.2.4离子束细胞融合技术雷电、辐射等自然过程中产生的低能离子可作用于生物体，20世纪80年头中
8、期，中国科学院等离子体物理探讨所的余增亮等人发觉并证明了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在，建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系. 在离子束与生物体相互作用中，粒子的植入、动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和跨膜电场的变更. 据此原理，发展了离子束诱导细胞融合技术。此项探讨一旦胜利，将变更传统的一对一细胞融合的弊端，削减供体细胞导入的染色体范围，使融合更具目的性，大大削减筛选的工作量，将是细胞融合探讨的一大进步.2.5非对称细胞融合技术非对称细胞融合技术，是利用某种外界因素- 常为：射线，辐照某一细胞原生质体，选择性地破坏其细胞核，并用碘乙酰胺碱性蕊香红6G处理
9、在细胞核中含有优良基因的第2种原生质体，选择性地使其细胞质失活.然后融合来自这2个原生质体品系的细胞，从而实现所需胞质和细胞核基因的优化组合，或使前者被打碎的细胞核染色体片段中的个别基因渗入到后者原生质体的染色体内，实现有限基因的转移，从而在保留亲本之一全部优良性状的同时改良其某个不良性状。细胞融合技术的应用3.1动物细胞融合技术的应用用于基因定位和绘制人类基因图谱 JP2 杂种细胞中某一染色体或其片段的存在与否与细胞的某一性状表达与否相联系，从而可以实现把基因定位于某一染色体或某一区段上。1967年Weise和Green发觉在人和鼠的融合细胞中，人的染色体优先丢失，并证明利用这一特点有可能对
10、人染色体上的基因进行定位。1970年Ruddle等起先系统地用融合细胞作为试验系统来绘制人类基因图。3.1.2 用于生产树突状细胞抗肿瘤疫苗 一般认为肿瘤细胞表面抗原不能诱导强的免疫应答反应，树突状细胞（dendritic cells,DCs）与肿瘤细胞融合形成的树突状细胞疫苗能够有效地激发机体的细胞免疫应答，无论是在动物探讨还是在人体早期临床试验中都证明这是一种便利、平安、可行的方法4。并且由于融合细胞可以在体内存活，因此可以维持较长时期的免疫应答，有利于诱发机体产生有效的抗肿瘤免疫。肿瘤抗原可以肽段或完整蛋白的形式与DCs结合，或者将肿瘤抗原基因转化进DCs中，使其内源性地表达抗原，这两种
11、方法在抗肿瘤免疫应答中均有效5-9，但适于免疫的肿瘤抗原与其基因难以鉴定从而限制了其应用2，有试验证明用这两种方法制备的肿瘤疫苗的免疫原性不与肿瘤细胞与树突状细胞干脆融合的异核细胞，融合细胞保持了DCs和肿瘤细胞的特性，并且能高效地将未知的肿瘤抗原提呈给免疫系统，今后肿瘤疫苗的探讨工作将集中在疫苗的纯化上，以期用高度纯化的杂合细胞来激发更为有效和剧烈的免疫应答反应，使得这种方法在临床应用中更为实际10-11。 3.1.3 用于生产单克隆抗体 使小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成能产生单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）的杂交瘤细胞，单克隆抗体具有专一性和灵敏性，作为理论探
12、讨的工具在病原检测和疾病治疗以与食品平安领域具有广袤的应用前景。1985年，中科院上海细胞生物学探讨所研制胜利抗北京鸭红细胞和淋巴细胞表面抗原的单克隆抗体，同时还与有关医学部门合作，胜利地制备了抗人肝癌和肺癌的单克隆抗体。在神舟四号上我国自制的细胞电融合仪分别进行了植物细胞的电融合试验和动物细胞的电融合试验，动物细胞电融合试验采纳纯化的乙肝疫苗病毒表面抗原免疫的小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，目的是获得乙肝单克隆抗体。目前有关单位利用McAb作用的专一性这一特点正在探究用“生物导弹”对癌症进行早期诊断和治疗。用于动物育种 体细胞核移植技术（somatic cell nuclear transfer
13、 technique,SCNT）是将细胞核移植到另一细胞的细胞质中的生物技术。动物体细胞融合后，杂种细胞难以发育再生为一个个体，但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移入去核成熟卵内，可培育新的杂种。另外，细胞核移植技术的建立，还为目前进行的哺乳动物体细胞克隆和转基因技术打下良好的试验基础1。用于细胞疗法 SCNT将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合，融合子进行有丝分裂形成囊胚，囊胚的内细胞团是多能干细胞，对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植，不仅解决了器官和组织来源问题，并且也避开了宿主对外来物的免疫排斥。3.1.6 动物体细胞融合在基础理论探讨方面的应
14、用 (1)用于探讨细胞的核质关系和个体发育。20世纪70年头初，诞生了细胞拆合工程。Carter于1967年发觉细胞松弛素B（CB）能诱发体外培育的小鼠L细胞的排核作用。Prescott等1972年首先应用离心术结合CB分别哺乳类细胞的胞质体获得胜利，为探讨哺乳类细胞的核、质相互关系、细胞质基因的转移开创了新的途径12。异核体和细胞杂合子被用来确定基因调整因子，这些调整因子确定一个细胞表型消逝或得以保持以与给予受体新性状；通过对供体和受体细胞全部细胞特异性基因表达探讨，细胞融合有助于人们了解发育，特殊是在探讨基因编码的可逆性方面。在个体发育过程中，血红蛋白存在着从胚胎型向胎儿型（幼虫）最终向成
15、人型的转换，对这些转换进行探讨，除了揭示基因依次表达的调控机理外，在医学方面也有意义，人们可以部分或全部扭转从胚胎型向胎儿型的转变从而治疗镰刀型贫血病13。（2）用于揭示疾病发生的机制。与其他技术结合运用，细胞融合是一种揭示疾病机理的有效方法。例如，细胞融合与免疫荧光，生化分析，电镜技术相结合，Lattanzi G等对肌肉萎缩症发生的机理进行了探讨14。（3）用于膜蛋白动力学探讨。细胞融合技术与显微镜技术结合运用被用来探讨膜蛋白动力学以与这些膜蛋白之间的关系，Pter Nagy等的探讨发觉大型膜蛋白群之间(主要组织相容性复合物major histocompatibility complex,M
16、HC，包括MHC 和MHC ）发生蛋白质交换，并且群内蛋白之间也发生蛋白移位，小蛋白群之间也存在着蛋白重排现象。3.2植物细胞融合技术 基础理论探讨 Yamagishi等设计了一种新的高效原生质体培育体系,增加了不对称杂交属内种间细胞融合率16。可以设想,细胞融合技术改善后,可把人参和冬虫夏草的细胞融合产生新的品种,并具备它们各自特有的药效。改善作物品质 杂种优势现象在生物界普遍存在,利用这一现象是提高农作物品质和产量的有效途径之一,即可以利用雄性不育系进行杂交一代种子生产。核基因限制的雄性不育的保持系很难解决,而细胞质雄性不育的不育系、复原系和保持系较易通过体细胞杂交短期内得到。培育抗逆植株 Shelley用马铃薯二倍体作亲本
