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1、酵母菌形态观察及其子囊孢子的观察安明玉（200900140001）同组者：陈汶灿、陈肖然、程彬、高琳璐、秦瑶一、实验目的1.了解酵母菌的形态及出芽方式；2.学习区分酵母菌死细胞及活细胞；3.掌握酵母菌子囊孢子的观察方法。二、实验原理酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见的细菌大几倍甚至几十倍，因此，不必染色即可用显微镜观察其形态。大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的二分裂殖；子囊菌纲中的酵母菌在一定条件下，可产生子囊孢子进行有性生殖。 酵母菌子囊孢子的形成过程为：两营养细胞各伸出一个小突起而相接触，使两个细胞结合起来，而后接触处的细胞溶解，经质配和核配后，形成双倍体核，原来的细胞
2、形成合子。此双倍体细胞可以进行芽殖。在适宜条件下，合子减数分裂，双倍体核分裂成4-8个单倍体核，核外再围以原生质逐渐形成子囊孢子，子囊孢子包含在由母细胞壁演变而来的子囊(即原来的二倍体细胞)中。子囊孢子的形成与否及其数量和形状，是鉴定酵母菌的依据之一。 将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)从营养丰富的培养基上移植到含有醋酸钠和葡萄糖(或棉籽糖)的产孢培养基上，于适温下培养，即可诱导其子囊孢子的形成。本实验即以酿酒酵母为材料观察酵母菌的子囊孢子。美蓝是一种弱氧化剂，氧化态呈蓝色，还原态呈无色。用美蓝对酵母细胞进行染色时，活细胞由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原
3、能力，能将美蓝由篮色的氧化态转变为无色的还原态型，从而细胞呈无色；而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则由于细胞内还原力较弱而不具备这种能力，从而细胞呈蓝色，据此可对酵母菌的细胞死活进行鉴别。三、实验材料1.菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；2.试剂0.1美蓝染色液、孔雀绿染色液、95乙醇、香柏油等；3.器材显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸等。四、实验步骤1.配制酵母合成培养基（见附录），用液体培养基培养的酵母菌接种，培养7天。2.酵母菌死活细胞的观察区分及出芽生殖1）染色：无菌环境下，在干净的载玻片中央加一小滴适宜浓度的酿酒酵母液体培养物，加
4、一小滴0.1%美蓝染色液（染色液和菌液不宜过多或过少，并应基本等量），然后轻轻从侧面盖上盖玻片，注意尽量不要产生气泡（注意染色液和菌液不宜过多或过少，并应基本等量）。2）镜检：将制好的染色片置于显微镜的载物台上，放置约3min后进行镜检，先用低倍镜，后用高倍镜进行观察，根据细胞颜色区分死细胞（蓝色）和活细胞（无色），并进行记录。3）比较：染色约30min后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。3. 子囊孢子的染色与观察1）制片在洁净载玻片的中央滴一小滴蒸馏水，用接种环于酒精灯火焰附近挑取少许菌至水滴上，涂布均匀，在酒精灯火焰上热固定（水和菌均不要太多，涂布时应尽量涂开，否则将造成干燥时间长；热
5、固定温度不宜太高，以免使菌体变形）。2）染色滴加数滴孔雀绿染色液，11.5min后水洗；加95%乙醇脱色30s，水洗；最后用番红染液复染30s1min，水洗，干燥。3）镜检将染色片置于显微镜的载物台上，先用低倍镜，后用高倍镜进行观察，子囊孢子呈绿色，菌体和子囊呈粉红色。注意观察子囊孢子的数目、形状，并进行记录。五、实验结果1.酵母菌死活细胞的观察区分及出芽生殖活细胞出芽生殖死细胞 图1.酵母菌细胞形态观察（3min，10100） 图2.酵母菌细胞形态观察（30min，10100）如图所示，显微镜下观察，酵母菌死细胞呈蓝色，活细胞无色，透明。染色30min后与染色3min后相比，死细胞明显增多，
6、活细胞明显减少。2. 子囊孢子的染色与观察酵母菌菌体或子囊酵母菌子囊孢子图3.酵母菌及其子囊孢子的观察（10100）如图所示，显微镜下观察，酵母菌子囊孢子呈蓝绿色，菌体和子囊呈粉红色。六、思考题美蓝染液作用时间的不同对酵母菌死细胞数量有何影响？是分析其原因？ 答：有实验结果可看出随着时间的增长，酵母菌的死亡细胞逐渐增多。原因是随着培养时间的增长，酵母菌产生的酒精增多造成酵母菌死亡增多，另外营养物质的减少也是原因之一。七、实验小结通过本实验我们了解酵母菌的形态及出芽方式，学会了如何区分酵母菌死细胞及活细胞，并掌握了酵母菌子囊孢子的观察方法。酵母菌是单细胞真核微生物，大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖。显微镜下观察酵母菌美兰浸片，可以看到酵母菌死细胞呈蓝色，活细胞无色，透明。附录酵母合成培养基酵母膏 0.5%葡萄糖 2%蛋白胨 1%pH 自然
