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1、毕 业 论 文（设计）论文题目 氮肥对水稻叶片RuBP羧化酶和SPS酶活性的影响 姓 名 沈知临 学 号 09122025 院 系 生命科学学院 专 业 09级生物科学 指导教师 高俊山 职 称 副教授 中国合肥二o一三年六月II安徽农业大学学士学位论文（设计）开题报告课题名称氮肥对水稻叶片RuBP羧化酶和SPS酶活性的影响课题来源973计划前期学生姓名沈知临专业09级生物科学学号09122025指导教师姓名高俊山职称副教授研究内容1. 不同处理下水稻叶片的摘取、保存；2. 测定不同氮肥营养水平下水稻叶片RuBP羧化酶和SPS酶活性；3. 比较两个水稻品种在不同生育期RuBP羧化酶和SPS酶活
2、性变化；4. 分析氮肥营养水平对水稻叶片RuBP羧化酶和SPS酶活性的影响；5. 对实验数据进行相关性分析，确定最佳氮肥营养处理水平。研究计划1 收集资料，查阅国内外相关文献，熟悉实验内容；2 撰写实验计划，制定实验方案；3 准备实验材料，配制实验试剂；4 进行实验，记录、收集数据；5 整理和分析数据，总结实验结果；6 撰写论文，进行答辩。特色与创新本实验利用不同氮肥条件对两种水稻进行栽培，测定水稻品种叶片中RuBP羧化酶和SPS酶活性的变化，从生理生化角度探讨不同氮素营养水平对水稻的相关光合作用酶活性及其部分产物含量的影响,系统分析并确定最佳的氮肥的施用量，减少过量施肥对土壤环境的影响，提高
3、水稻的产量。指导教师意见教研室意见院系意见 主要领导签名： 2012 年 9 月 20 日V目 录1. 前言11.1 Rubisco的功能及活性调节11.2 SPS的酶学特性及在蔗糖代谢中的作用21.3 本实验的目的和意义21.3.1 实验目的21.3.2 实验意义22. 实验材料与方法22.1 实验材料22.2 实验试剂及仪器设备32.2.1 主要试剂32.2.2 主要仪器32.3 实验方法32.3.1 RuBP羧化酶活性的测定32.3.1.1 实验原理32.3.1.2 试验步骤32.3.2 SPS酶活性的测定42.3.2.1 实验原理42.3.2.2 试验步骤42.4 数据处理53. 实验
4、结果与分析53.1 不同氮肥水平对RuBP羧化酶活性的影响53.1.1 两个水稻品种开花期RuBP羧化酶活性的变化53.1.2 两个水稻品种成熟期RuBP羧化酶活性的变化63.1.3 Q114品种水稻在两个时期中RuBP酶活性的变化63.2.1 两个水稻品种开花期SPS酶活性的变化73.2.2 两个水稻品种成熟期SPS酶活性的变化73.2.3 Q96品种水稻在两个时期中SPS酶活性的变化83.3 氮肥水平对水稻叶片蔗糖含量的影响83.4 相关分析93.4.1 氮肥与两个时期Q96水稻RuBP酶活性93.4.2 氮肥与两个时期Q96水稻SPS酶活性94. 结论与讨论104.1 结论104.2 讨
5、论104.2.1 氮肥与RuBP羧化酶活性104.2.2 氮肥与SPS活性114.2.3 氮肥与蔗糖含量11致 谢12参考文献13英文摘要14VIII氮肥对水稻叶片RuBP羧化酶和SPS酶活性的影响作者：沈知临 指导老师：高俊山（安徽农业大学生命科学学院09生物科学1班，安徽合肥，230036）摘 要：在农作物的生长发育过程中，氮肥是重要的因素之一，过度施氮或施氮不足都会影响农作物的代谢中的关键酶活性，最终会影响农作物的产量。水稻是重要的粮食作物，氮肥施用量影响其光合作用及光合产物的运输，进而影响水稻的产量和品质。本实验重点研究了氮肥对水稻中RuBP羧化酶和SPS酶活性的影响，从而探索氮肥对水
6、稻生长的最适水平。结果表明，不同施氮条件下水稻叶片RuBP酶活性都是开花期最高，到成熟期又呈下降趋势；低施氮量与RuBP羧化酶活性呈显著正相关。而SPS酶活性在开花期含量很高，到成熟期下降。同时，低水平氮肥处理时SPS酶活性最低。这些结果为水稻生育期中合理施用氮肥提供了理论基础。关键字：水稻 氮肥水平 RuBP羧化酶 SPS酶 活性 1. 前言氮是核酸和氨基酸的必要组成成分之一，在植物生化进程中，叶片的光合作用是对氮供给最敏感的代谢反应之一。氮缺乏或过量都会导致叶绿素含量、同化力合成、酶含量和酶活性的下降1，并进一步导致植物叶面积降低和光合同化物的减少及加速生殖生长进程2。可溶性蛋白氮(如Ru
7、BP羧化酶)在大多数C3植物中的含量大约是植物叶片蛋白质的一半以上，在C4植物的含量约是植物叶片蛋白质的1/43。RuBP羧化酶催化C3植物的碳同化过程中RuBP的羧化反应。蔗糖是植物重要的光合产物，是植物体内同化物运输的主要形式。蔗糖磷酸合成酶（SPS)是植物体内催化蔗糖合成的一种酶。Harbron等(1981)曾指出蔗糖磷酸合成酶有可能是蔗糖合成途径中的一个重要的控制点，它的活性反映了蔗糖生物合成途径的能力。Doehlert和Huber(1983)对大豆研究均表明，蔗糖磷酸合成酶(SPS)是影响大豆叶片中蔗糖合成的关键酶，而李永庚等(2001)也发现磷酸蔗糖合成酶在小麦旗叶光合产物向蔗糖的
8、转化过程中起关键性调节作用。1.1 Rubisco的功能及活性调节Rubisco能催化双重反应即：(1)羧化反应，形成二分子3-磷酸甘油酸的1，5二磷酸核酮糖(RuBP)的羧化作用；(2)加氧反应，形成磷酸乙醇酸和3-磷酸甘油酸各一分子的RuBP的加氧作用，而继续形成的乙醇酸是光呼吸的底物。已经表明O2是羧化反应的竞争性抑制剂，而CO2是加氧反应的竞争性抑制剂，且这两个反应的相对速度取决于CO2和O2的相对浓度，低的CO2/O2比值可以促进加氧反应，而高的CO2/O2比值则可以促进羧化反应，在正常空气中（O2为21%，CO2为0.03%），C3植物中大约有30%向加氧反应进行,而70%则向羧化
9、反应进行。另外温度和pH值也影响这两种反应的相对速度。4-6关于RuBP羧化酶在体内活化的调节，有实验证明不仅环境因素如温度、湿度、CO2浓度、光强等因素(尤其是光强，因为光照可活化此酶)对其活性有调节作用，而且在植物体内pH值、CO2、Mg2+浓度、ATP/ADP比值等这些生理因子也会影响其活性。最近几年来已发现植物体内存在一种RuBP羧化酶的活化酶可催化Rubisco的氨基甲酰化作用，这种活化作用需要ATP，并且还证明了纯的活化酶还能催化ATP的水解。与此同时，还发现植物体内还存在一种RuBP羧化酶专一的内源抑制剂，即2-羧-D-阿拉伯糖醇1-磷酸(CAIP)，这种抑制剂在黑暗条件下在体内
10、的浓度增加，可与氨基甲酰化的酶相互结合。光照条件下，这种抑制剂又和酶分离。7,81.2 SPS的酶学特性及在蔗糖代谢中的作用该酶的最适pH值约7.0，UDP、UTP、ATP能明显地抑制其酶活，UTP是该酶UDPG的竞争性抑制剂，Mg2+对它有促进作用，G6P则无影响。酶的两个底物F6P及UDPG的饱和动力学曲线分别为双曲线型和S型，Km(UDPG)= 20.0mmol/L；Km(F6P)= 0.93mmol/L，Vm(UDPG)=333nmol Suc mg-1 protein min-1；Vm(F6P)= 83.3nmol Suc mg-1 protein min-1，Hill(F6P=l.
11、0；Hill(UD PG)=1.4。水稻叶片蔗糖磷酸合成酶的活性受UTP、ATP、UDP、UDPG等因素的调节9。蔗糖是高等植物光合作用的主要产物，是碳运输的主要形式，也是“库”代谢的主要基质。蔗糖也是许多果实中糖积累的主要形式，是果实品质形成的重要因子。此外，它还是细胞代谢的调节因子，可能通过影响基因表达发挥作用。而SPS却在蔗糖代谢中起着重要的作用。10 1.3 本实验的目的和意义1.3.1 实验目的本文选用不同氮肥处理下对两种水稻的培育，分别对其不同生育期的RuBP羧化酶和SPS酶活性进行了初步研究，从而揭示不同氮肥条件下RuBP羧化酶和SPS酶活性的变化规律, 进而探讨RuBP羧化酶和
12、SPS酶活性与水稻产量的关系。1.3.2 实验意义本研究从氮肥对RuBP羧化酶和SPS酶活性的影响入手，旨在探索水稻在不同氮肥条件下，生长发育过程中代谢反应中一些关键酶活性的变化以及一些产物含量的变化，从而找到最适合水稻生长发育的氮肥水平，进一步提高水稻产量和质量，避免氮肥的浪费，保护土壤环境。2. 实验材料与方法2.1 实验材料 实验所选材料来自于安徽省农业科学研究院水稻研究所培育的水稻品种，选取不同氮素水平处理下Q96和Q114两个叶片品种，分别采取不同发育时期的水稻叶片，经液氮处理后保存备用。氮水平处理方式如下：A无氮处理为不施氮肥；B低氮处理为基肥0.416g/盆；蘖肥0.312g/盆
13、；穗肥0.312g/盆；C中氮处理为基肥1.240g/盆；蘖肥0.930g/盆；穗肥0.930g/盆；D高氮处理为基肥1.656g/盆；蘖肥1.224g/盆；穗肥1.224g/盆。2.2 实验试剂及仪器设备2.2.1 主要试剂 DTT，NADHNa2，6-磷酸果糖，牛血清蛋白（Solarbio公司产品），ATP，1,5-二磷酸核酮糖，3-磷酸甘油酸激酶，3-磷酸甘油醛脱氢酶，UDPG（SIGMA公司产品），乙二醇，乙醇（95%），36%盐酸，甘油，无水乙酸镁，间苯二酚，蔗糖，Tris，MgCl26H2O，乙二胺四乙酸二钠，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，碳酸氢钠，氢氧化钠。2.2.2 主要仪器 LK
14、-S3D型三温三控水浴锅（中仪国科（北京）科技有限公司），电子分析天平（奥豪斯国际贸易（上海）有限公司），3K30台式高速冷冻离心机（SIGMA公司），日立U-2900双光束分光光度计（Hitachi High-Technologies Corporation Tokyo Japan）。2.3 实验方法2.3.1 RuBP羧化酶活性的测定2.3.1.1 实验原理 RuBP羧化酶催化RuBP与一份子CO2结合，产生两分子PGA，PGA在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下，产生3-磷酸甘油醛，并使还原型辅酶I（NADH）氧化，反应如下：RuBP+CO2+H2O-2PGA3-PGA+ATP-1,3-二磷酸甘油酸+ADP1,3-二磷酸甘酸+NADP+H+-3-磷酸甘油醛+NAD+通过上述偶联反应，可将3-PGA的变化转变为NADP的变化来测定，因此可用紫外分光光度计在340nm处测定NADP的减少量来计算酶活力。2.3.1.2 试验步骤 1.酶提取 取新鲜水稻叶片0.125g，洗净擦干，充分研磨，加入10mL预冷酶
