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1、Pergamon 神经药理学，36卷；8期，第10231030页，1997年Elsevier科技有限公司，版权所有印刷地为英国00283908/97 17.00美元前列腺素E1阻止大鼠脊髓背侧角表面神经细胞凋亡 日本大阪绿十字公司中心研究实验室（1997年5月15日接受）摘要在形态学和组织化学方面，神经元变性与神经元坏死之间有显著差别。本研究通过慢性缩压大鼠坐骨神经来诱导腰椎脊髓背侧角神经元变性。在接受坐骨神经外源兴奋刺激的脊髓区域神经元细胞出现凋亡，凋亡经TUNEL-染色和基因组DNA电泳得以证实。凋亡神经元的形态学改变包括经甲苯胺蓝染色后有黑神经元出现。为保持化学成分稳定及能够定向运输，将
2、PGE1装入脂质体微囊，10g/kg的前列腺E受体拮抗剂脂质体-PGE1几乎能阻断所有黑神经元的产生，而同样剂量和剂型的前列环素（IP）受体拮抗剂羰环素则无此作用。脂质体-PGE1也能够阻断脊髓受累区域组织基因组DNA片段电泳“梯子”的形成。由于慢性损伤和有扩张作用的前列腺素都不会影响脊髓下局部区域的血流量，脂质体-PGE1的作用一定是通过其他机制来实现的。本研究结果表明，EP受体拮抗剂PGE1能有效阻断坐骨神经缩压性损伤造成的神经元凋亡，而IP受体拮抗剂羰环素则无此作用。1997年Elsevier科技有限公司。关键词前列腺素E1，凋亡，黑神经元，脊髓，坐骨神经缩压损伤，前列腺素E(EP)受体
3、神经元凋亡目前已成为神经科学研究领域的主要任务之一。在各种神经系统疾病中，阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩性脊髓侧索硬化病都具有特定神经功能缓慢丧失的特点，这种现象可能是由凋亡造成的（Craig， 1995）。近年来，一些与凋亡诱导(Miura et al., 1991; White et al., 1994)或抑制（Gregory et al., 1991； Gonzalez-Garcia., et al., 1994）相关的转录因子基因相继得以克隆。此外，有些细胞内信使与细胞核损伤的诱发和抑制密切相关（Schultze et al., 1994；Ojeda et al., 1995）。有报道
4、称，细胞内环-AMP浓度的升高可以通过与坏死不同的方式导致细胞死亡（Weiss et al., 1995）。不过，也有报道称环-AMP能够抑制细胞凋亡（Alok et al., 1994）。有关环-AMP在介导凋亡过程中的作用还存在争议。前列腺素（PG）E1/E2和前列环素（PGI2）通过活化鸟苷酸结合蛋白Gs使细胞内环AMP的浓度升高（Gilman， 1984；Schramm和Selinger），这可能也会对细胞凋亡有影响。例如，PGE2能抑制淋巴瘤细胞的凋亡（Goetzl et al., 1995），但却能启动胸腺细胞的自杀程序（Saiagh et al., 1994）。对于神经元的凋亡，
5、PGE1/E2或PGI2的作用目前尚不明了。前列腺素受体基因最近相继得以克隆，通过Northern Blot和原位杂交分析已基本搞清了前列腺素受体的定位。神经元细胞表面存在EP和IP受体（Sugimoto et al., 1990a；Sando et al., 1994），因此推测二者在神经元生理调节方面发挥重要作用。例如，突触有可能就是主要由前列腺素介导的神经元组成之一（Yamagata et al., 1993）。因此，前列腺素样拮抗剂有可能具有介导神经元变性的药理作用，如凋亡。脂质体-PGE1是一种包被型PGE1，它是一种EP受体拮抗剂，脂质体微球可以延长PGE1的半衰期，并能使药物进行
6、靶向运输而发挥作用（Mizushima和Hoshi, 1993）。对于糖尿病神经变性（Toyota et al., 1993; Tawata et al., 1991）、神经性疼痛（Kamiyama et al., 1991）和周围动脉阻塞性疾病（Mizushima et al., 1987），目前已有关于脂质体-PGE1治疗有效的报道。将坐骨神经造成慢性缩压性损伤（Bennett和Xie，1988），我们以大鼠脊髓为模型对缺血依赖性神经变性（包括黑神经）进行了研究，并对比了脂质体-PGE1和化学成分稳定的IP受体拮抗剂羰环素的不同作用。表1. 目标脊髓神经元区非缺血性神经变性的证据治疗方法剂
7、量（g/kg）血流量（ml/min/100g组织）空白对照6.90.7空载体7.90.5脂质体-PGE117.40.636.60.8107.02.3羰环素17.50.236.30.4107.20.4利用激光多普勒技术检测腰椎四五段脊髓背侧角的脊膜局部血流。数据表示为SEM（源于四只大鼠测量结果）。在14天缩压性坐骨神经损伤过程中同时给予脂质体-PGE1或羰环素，结果局部脊膜血流量无变化。材料和方法采用苯巴比妥钠腹膜内注射法（40mg/kg）麻醉雄性Wistar大鼠（200250克）。用四条软绷带缓慢勒紧坐骨神经诱发神经变性（Bennett和Xie，1988）。将股二头肌钝性分离，暴露粗大的坐骨
8、神经。在坐骨神经近端至三叉分支处大约7毫米长的神经通路上将粘附的组织剥离，按1毫米间距将4条绷带（4.0铬肠线）宽松地系到神经上。其中一组采用单侧空白手术（仅暴露坐骨神经，但不进行结扎）。术后每日一次静脉注射脂质体-PGE1和PGI2-类似物羰环素，用药总时长为两周。实验动物一共分七组：脂质体-PGE11g/kg、脂质体-PGE13g/kg和脂质体-PGE110g/kg剂量组；羰环素1g/kg、羰环素3g/kg和羰环素10g/kg剂量组；空载体组。用药结束第2天，腹腔内注射苯巴比妥钠（40mg/kg）麻醉动物，显微手术暴露腰椎L4L5段。激光多普勒检测仪检测局部血流量（高级激光流量检测仪，AL
9、F2100, 日本）。上述检测完成以后，分离腰椎脊髓，在L4和L5之间将脊髓反向离断成两段。将含L4一端的胸椎段（T13）作为阴性对照，于-70C冷冻以备基因组DNA电泳分析。包含L5的另一脊髓段置于10福尔马林中性缓冲液中浸泡，用作甲苯胺蓝染色或TUNEL分析。利用基因组DNA纯化试剂盒（BIO 101 Inc., CA，U.S.A.）纯化分离胸段和腰段脊髓基因组DNA，然后进行电泳分析。纯化后的基因组DNA样品与低熔点琼脂糖凝胶混合，然后加入到干燥的2（w/v）琼脂糖凝胶孔中。将取自L4和L3脊髓段的10微克的总DNA进行电泳分离，然后用溴化乙啶染色观察。甲苯胺蓝染色法识别黑神经元。另一半
10、取自L4L5的脊髓段在2的OsO4中浸泡2小时，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋。每一个脊髓段每100m制一个厚度为5m的组织切片，并将组织切片置于载玻片上以明胶封片。然后以浓度为1甲苯胺蓝和1硼酸钠的水溶液在65C条件下染色2.5分钟。为确保每一份标本上所计数的细胞总数相同，在显微镜下以2.8104m2面积内的全部黑的或凋亡神经元细胞的绝对数来计算细胞的变性率。所观察区域的细胞数在247895之间。在不同的给药组之间，以及给药组和对照组之间，细胞总数无显著差别。用C-成像系统 （Compix Inc.,PA, U.S.A.）计数细胞数量。在分析DNA片段时，将另一半主要含L5的脊髓组织段脱腊，用于
11、特殊标记进行原位杂交分析DNA碎片（用生物素化dUTP进行TUNEL染色；Gavrieli et al., 1980）。以四只大鼠的测量结果作为实验结果，记录为均数SEM。采用Dunnett法或t-检验分析分别计算空白载体组和不同药物组，空白手术组和坐骨神经缩压损伤组以及空白载体组之间的统计学差别。如p值小于0.05，则认为组间差异显著。结 果术后两周，任一实验组的腰椎侧角脊膜血流量无明显变化（见表1）。实验初期（第1和第5天），脊膜局部血流量的基础值稍低，但变化不明显，在6.5和8.0ml/min100g之间波动。前列腺素类药物的应用对每日测量的血流量无影响（数据未显示）。在空白手术组，黑神
12、经元出现率极低（图1A和2）。单侧缩压损伤的大鼠，同侧腰椎侧角第1段和第2段组织切片上的黑神经元发生率增加了八倍（图1B和2）。在脂质体-PGE1组，同一区域黑神经元发生率非常低，与空白手术组的黑神经元数相比，二者无显著差异（图1C和2）。但羰环素对脊髓伤侧黑神经元的出现率没有影响（图1D和2）。图1.显微镜下观察大鼠腰椎脊髓侧角表面出现的黑神经元和前列腺素类物质的抑制作用。与空白手术组健康脊髓神经元（A）相比，空白载体组（B）在慢性坐骨神经缩压伤后第14天，黑神经元经甲苯胺蓝染色后呈现黑色颗粒样表现。在慢性坐骨神经缩压伤的14天中，同时给予脂质体-PGE1（10g/kg/d），能够抑制黑神经
13、元的出现（C）。但在慢性坐骨神经缩压伤的14天中如同时给予羰环素（10g/kg/d），则对黑神经元的出现完全没有抑制作用。图2.坐骨神经缩压性损伤同侧（左侧条形图）及对侧（右侧条形图）腰椎脊髓侧角黑神经元的出现率增加的情况以及前列腺素类物质的抑制作用。条形图代表的是四只大鼠的实验结果，表示为均值SEM。分别采用t-检验和Dunnett法计算慢性缩压性损伤组、空白载体对照组、空白手术组（*p0.01）或慢性缩压损伤组以及给药组（*p0.01）之间的统计学差异。与对侧相比，在一定观察面积内（2.8104m2），缩压损伤同侧的腰椎脊髓黑神经元的发生率明显增高。连续14天给药以后，脂质体-PGE1能以
14、剂量依赖性的方式阻断上述现象，但羰环素则对神经变性无明显抑制作用。图3 胸椎脊髓和腰椎脊髓侧角基因组DNA的电泳图。图中的电泳条带分别代表以下样品：DNA分子量标准（第1带），来源于胸椎脊髓13段的DNA（第2带），经14天坐骨神经缩压性损伤的大鼠腰椎脊髓第4段侧角的基因组DNA（第3带）。每份DNA样品取10微克用于2琼脂糖凝胶电泳分析，电泳后用溴化乙啶进行DNA染色观察。腰椎第4段脊髓侧角接受来自坐骨神经的传入冲动，取自该段脊髓的基因组DNA呈现与核小体大小一致的条带；胸椎第13段脊髓不直接接受来自坐骨神经的冲动，取自该段脊髓的基因组DNA电泳后无碎片样表现。图4 坐骨神经经过14天缩压性
15、损伤后，同侧腰椎脊髓侧角DNA的碎片图形和脂质体-PGE1的抑制作用。图中条带依次为以下样品的DNA电泳图形：分子量标准（第1带），空白手术组基因组DNA（第2带）；有坐骨神经缩压性损伤的空白载体组基因组DNA（第3带），取自有坐骨神经缩压性损伤动物经脂质体-PGE1用药（1和10g/kg/d）后的基因组DNA（第4和第5带），取自有坐骨神经缩压性损伤动物经羰环素用药（1和10g/kg/d）后的基因组DNA（第6和第7带）。每份DNA样品取10微克用于2琼脂糖凝胶电泳分析，电泳后用溴化乙啶进行DNA染色观察。动物在坐骨神经缩压性损伤的同时给予14天的脂质体-PGE1（1，10g/kg/d）能够阻止基因组DNA出现碎片条带，但无论羰环素剂量如何改变，它都不具有这种预防作用。图5.在14天坐骨神经缩压性损伤后，大鼠腰椎脊髓侧角表面神经元的显微镜下图形。用原位杂交末端标记染色法检测脊髓段的凋亡细胞。在空白载体处理组（B），在14天坐骨神经缩压损伤后，观察到了凋亡细胞的存在，而空白手术对照组则没有观察到这种变化（A）。与羰环素（D）不同，脂质体-PGE1（10g/kg/d，C）给药后，能够抑制动物出现凋亡。在单侧缩压损伤大鼠，观察到腰椎脊髓L4段的基因组DNA呈现一种DNA片段梯形分布与完整DNA共存的现象。相反，在同一只大鼠的胸
