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1、实验四 细菌总数的测定 纯种分离一、目的1.掌握从环境（土壤和活性污泥等）微生物群体中获得纯种微生物的分离和培养技术。2.掌握无菌操作技术。二、材料和器皿1. 扭力天平、取土样工具、涂布棒(接种棒)。 2. 无菌三角瓶、试管、培养皿、移液管、玻璃珠。 3. 无菌水。 4. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。三、实验操作步骤1、取土样 选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取210cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。土样取回后应尽快投入实验，同时取10-15g，称重后经105oC烘干8h，置于干燥器中冷
2、却后再次称重，计算含水量。2、 倒平板 熔化已灭菌的上述4种培养基并冷却至45oC左右倒平板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。3、编号 取5支无菌空试管（15150mm）依次编号为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。4、分装无菌水 按无菌操作用5mL移液管分别吸取4.5mL无菌水于编号的各无菌空试管中。5. 制备土壤稀释液 称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡1020min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次、摇匀，此即为10-3浓度
3、。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。 代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨； 液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。 减少误差：每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入， 勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。6、培养及计数培养条件：倒置于361温箱内培养482h计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放 置于04，但不得超过24h。计平皿中菌落数：肉眼观察，必要时用放大镜检查。记下各平板的菌落总数，求出同稀 释度的各
4、平板平均菌落数。规律：不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落 数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈 多。 如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现 象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。 当计数平板内的菌落数过多
5、（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。 计数原则：选平均菌落数在30300之间者进行计算1.仅1个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报 告之。2.若有2个稀释度的平均菌落数在30300之间时，则按两者的菌落总数之比来决 定，若比值小于2应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小的菌落总数。3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍 数报告之。4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀 释倍数报告之。5.若所有稀释度的平均菌落数均不在
6、30300之间，则以最接近300或30的平均菌 落数乘以稀释倍数报告之。6.若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最大稀释倍数。7.在求同稀释度的平均数时，若其中1个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约为平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数，然后乘以2作为整个平板的菌落数。报告原则例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌 菌落数报告方式10-110-210-3 落数之比 (个/mL)(个/mL)11365164 201640016000或1.610422760 295 461.6377503
7、8000或3.810432890271602.22710027000或2.71044无法计数4650513513000510000或5.1105527115 270270或2.71026无法计数305123050031000或3.11047无法计数 10-3无法计数7、菌落总数报告方式菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。为了缩短数字后面的零位，可用10的指数来表示。 固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（mL）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。8. 计数 选菌落分散、菌落数适量且各平行皿菌落数接近的稀释度的平皿计数，通常细菌和放线菌选取菌落数在30300之间的平皿，霉菌选菌落数在10100之间的平皿，最后换算成每克干土所含菌数。 同一稀释度的平均菌落数稀释倍数每克干土含菌数 = 1土壤含水量四、思考题1.用一根无菌移液管接种几个浓度的水样时应从哪个浓度开始？为什么？2. 琼脂平板接种后，为什么要倒置培养？
