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1、 关节软骨损伤修复刘延青关节软骨破坏是骨关节病的主要病理改变,外伤等原因所致软骨损伤最终也会导致骨关节病.软骨损伤后没有或很少有自我修复能力。因此软骨修复成为骨科领域重要问题。 一.软骨损伤后的自我修复 正常关节软骨为透明软骨,由软骨细胞和基质及纤维组成。近关节面软骨细胞较小而幼稚,软骨生长时细胞渐向深部移动,体积变大形成2-8细胞群,周围有软骨囊;基质化学成份为软骨粘蛋白,其主要成份是酸性糖胺多糖(GAG);纤维为胶原原纤维,主要是II型胶原。糖胺多糖和II型胶原对维持透明软骨弹性好,耐磨损,低磨擦的特性起重要作用。 未穿透全层的软骨损伤,由周围软骨细胞分泌基质和纤维化愈合1;损伤至全层和软
2、骨下骨由纤维样软骨愈合。如损伤部位与骨髓腔相通且较小,可被骨髓细胞修复,两月后由纤维软骨充填,仍不同于正常透明软骨,且修复组织不与周围组织结合,随时间延长而退变崩解1、2。这种修复能力在年轻动物比年老动物强,可能与骨髓成骨干细胞的数目和活性有关。Furukawa.T等3分析软骨自身修复后胶原成分变化,4周I型40%,II型60%,12周主要为II型胶原6月后胶原含量较正常多,而氨基己糖(hexosamine)较正常少,提示修复组织纤维样结构是缺少蛋白多糖(proteoglycan)引起的,而不是胶原型的变化。二. 人为干预软骨修复1.软骨下骨钻孔修复软骨缺损 如前所述全层软骨和软骨下骨损伤有一
3、定的修复能力,将部分软骨损伤钻孔至软骨下骨可诱导修复,修复组织起源于松质骨中具有成骨能力的间充质干细胞,修复组织为类透明软骨。Mithchell.N等认为修复组织1年时变为纤维软骨:深层保持了正常软骨细胞而表层为典型纤维软骨。有报道认为实际的修复率相当低(10-20%),且只见于年轻动物5。原因是成骨干细胞数目不足以充填缺损,另外修复过程太慢导致纤维化和修复失败4。2.软骨移植早在1836年Paul Bret首先进行动物自体软骨移植;1908年Lexer进行了23例全关节移植和11例半关节移植;Pap于1961年开展带薄层骨关节软骨移植(shell osteochondrol grafts)。
4、自体软骨移植远近期效果都是满意的,可是来源有限不能满足临床需要。异体软骨移植由于免疫排斥远期会发生退变,但也有人认为软骨为弱抗原,细胞被包在基质中不与宿主淋巴细胞和抗体接触。3.骨膜及软骨膜移植1972年Tonna证实骨膜成骨性细胞本质是一种成骨,成软骨双重潜能细胞,其分化方向由所处环境决定6。现在认为在低氧环境骨膜细胞分化停滞在软骨阶段7。关节内是乏血管区,其分泌滑液氧张力低,有利于软骨形成。此外负重和活动亦促进软骨行成。韩一生等8对比骨膜和软骨膜修复软骨全层缺损,证明:两者均能再生为成熟透软明软骨,胶原的氨基酸组成不同于纤维软骨,接近透明软骨;24周软骨膜再生II型胶原,骨膜再生I,II型
5、混合胶原;且再生软骨表面光滑,与周围组织愈合牢固。骨膜移植后II型胶原与蛋白多糖含量逐渐上升,1年时II型胶原占80%表明成份接近正常透明软骨3。Ritsilla9较早将骨膜移植用于临床修复软骨损伤。12例年轻患者随访一年,症状改善,关节镜检查:软骨平滑,3例组织活检证实为透明软骨。此后Pastacadi10骨膜移植治疗类风湿腕关节炎;Havid11治疗创伤性膑骨软骨软化症,都收到满意效果。Homminga GN等12治疗25人30膝，病因包括:外伤、骨软骨炎、软骨软化，症状、体征评分改善,缺损被类似关节软骨组织充填。4.软骨细胞移植自60年代中期开始关节软骨分离和体外培养为软骨修复提供了新的
6、方法-软骨细胞移植。Peterson于1984年报道兔软骨细胞移植13。Brittberg M等,Takashi Noguchi等14,Grande DA等也从事了类似的实验。实验动物术后1天跛行,2-3天恢复正常步态;4周修复组织边缘清楚,12周表面平滑透明,边缘模糊,1年组织仍保持平滑透明边界不清14。镜下2周大部分缺损由透明软骨充填,4周仍为透明软骨,表面平,12周软骨下开始骨化,1年时仍保持透明软骨14。体外培养证明软骨细胞产生透明软骨,同时可被促使发展成肥大软骨细胞。肥大软骨细胞在体内刺激血管和骨髓侵入,继而软骨内骨化。Freed LE等15以番红-O染色蛋白多糖,trichome染
7、色胶原，结果表明移植后两者含量逐渐上升,30天分别达到4% -8.3%和7% -20%，正常软骨蛋白多糖和胶原分别为9.71%和801.6%。Frenkel SR16体外培养软骨细胞6月时II型胶原,蛋白多糖达到正常水平。这为软骨细胞移植修复软骨损伤奠定了理论基础。1994年Brittber等17报道临床应用软骨细胞移植的结果:23例外伤病人,全层软骨缺损1.6-6.5cm2,关节镜下取同侧未受损软骨体外分离培养14-21天,细胞悬液50-100ul,细胞数2.6-5106注入缺损处表面覆盖骨膜.随访16-66月结果优或好16例,一般3例,不好4例,22例活检:12例证实损伤由透明软骨修复。以
8、II型胶原抗体C11B1,C11C1和C11C2对5例标本分析都为阳性。这一技术已商业应用(Genzyme Tissue Repair(Boston Mass USA)。5.未分化间充质细胞移植 未分化间充质细胞是骨,软骨,脂肪,皮肤,肌腱等组织的发生源。就成骨能力分为不依赖细胞和间质之间相互关系而直接向成骨细胞分化的确定性骨祖细胞(determined osteogenic precursor cell DOPC)和需要诱导物才能成骨的诱导性骨祖细胞(inducible osteogenic precursor cell IOPC)。骨髓基质是在骨髓腔内对成血干细胞起连接和支持作用的细胞,包
9、括成纤维样细胞,网状细胞,脂细胞,成骨细胞和骨系细胞,还包括巨噬细胞和内皮细胞。未分化间充质细胞被认为存在于骨髓基质细胞和骨膜,软骨膜中18。骨髓细胞培养,成纤维样细胞贴壁生长,血细胞不贴壁换液时会被弃去。成纤维样细胞有很强的增能力,形成细胞集落,被称为成纤维细胞集落形成单位(CFU-F), 5103-104个细胞的集落的10%可以在初代培养中10-15次倍增。这些集落的成骨潜力可以维持3代(相当22次倍增)19。细胞在扩散格中的分化过程,最初I型,III型胶原, 层粘连素(laminin)和纤维连接素组成的软纤维组织,此后III型胶原,纤维连接素和层粘连素减少,且在骨形成区I型胶原增多20。
10、这一过程重现了胚胎骨发育过程。为未分化间充质细胞修复软骨缺损奠定理论基础。未分化间充质细胞移植的动物实验:Wakitani-s21兔骨髓穿刺分离基质细胞体外培养10-14天融合,收集细胞106 /0.2ml与I型胶原载体混合植入骨钻造成的关节缺损。2周缺损处开始软骨细胞分化,12周修复组织为透明软骨,较正常软骨薄,有软骨下骨形成。24周修复组织较2周薄但仍平滑。以微痕法(microindentation)检测软骨顺应性,细胞移植组顺应性比空白组小(较硬);比正常组织大(较软)。Robinson-D等22以碳纤维网吸附来源于骨髓未分化间充质细胞的软骨细胞进行关节软骨修复,证明修复组织为透明软骨。
11、练克检等23以异体骨基质海绵吸附自体骨髓细胞修复关节软骨,4周出现明现软骨细胞表型,16周移植区似正常软骨结构,但较薄。Butmariu-Ephrat-M等24以骨髓未分化间充质细胞分化的软骨细胞修复关节软骨,3月修复组织的软骨细胞形态及胶原,糖胺多糖含量与正常组织有区别,但优于无细胞的移植对照。Chu-CR等25以异体骨膜细胞移植修复兔关节软骨，修复组织的组织学和生物化学特性15/16例与正常软骨相似。Chu-CR等261997年报道82例兔的异体软骨膜细胞修复关节软骨试验,1年后由软骨样组织充填占70例(85%),修复组织主要为II型胶原,但糖胺多糖一直低水平,压缩(compresive)
12、特性与正常软骨无明现区别。Wakitani-s等21比较骨膜和骨髓基质细胞修复关节软骨,两者都可分化关节软骨及软骨下骨,组织学评分和力学特性无明现区别。未分化间充质细胞修复关节软骨尚未见临床报道。6.移植修复软骨的影响因素(1) 足够的修复细胞:软骨自身没有或很少有修复能力,各种修复方法都要提供足够的修复细胞。软骨移植细胞可取自关节软骨,肋软骨,胚胎软骨,骺板,有实验提示范骺软骨细胞优于关节软骨,在软骨下区有软骨骨化现象更接近正常软骨生长过程。软骨细胞经三代其形态与原代相似,而糖胺多糖和胶原量高于原代,提示有限传代不应响软骨再生能力15,软骨膜,骨膜,骨髓基质中含有未分化间充质细胞,有很强的增
13、殖力,符合胚胎骨,软骨的发生,但其修复作用是否优于软骨细胞未见报道。关于移植细胞数目无比较研究,多数实验106/ml数量级,根据缺损大小植0.1-1ml25、21。(2) 合适的载体:理想的材料应具备27: a.组织相容性,应不能引发可能削弱新组织功能的邻近组织的反应。b.可吸收性,最终材料完全被移植床吸收取代,吸收率要与组织修复速度相配。c.易于重复制作,可加工成各种形状。d.材料表面与移植细胞相互作用,以保留分化细胞的功能,或促进生长的可能。目前材料包括人工合成高分子材料，如多聚乳酸(PLA)和多聚羟基乙酸(PGA),生物体成份，如胶原。 PLA和PGA基本能满足上述要求,可以制成各种形状
14、三维多孔固体,多孔性达90%,以水解方式降解,降解率可调整。体外培养,软骨细胞可进入PGA并分泌胶原,PGA增加细胞蛋白多糖分泌。体内实验也证明PGA,PLA降解同时组织得到修复15。美国FDA已批准PGA,PLA作为医用材料体内使用。 胶原为透明软骨的重要成份,软骨细胞在含胶原的培养基中可以很好生长。实验中常用I型胶原和II型胶原。II型胶原可以保持软骨细胞圆形和较高分泌蛋白多糖能力,因此被认为更适合作为软骨细胞载体28。其缺点是体积可压缩,水合后失去原有形状,吸收过快。 脱钙骨基质,透明质酸,纤维蛋白,碳纤维等载体见各别报道。(3)损伤模型:损伤大小，部位, 深度都会影响修复。损伤面积大可
15、以排除自我修复的影响，多大面积无法自我修复没有统一数值，不同动物也有差别，比如直径3mm对于狗膝关节是小缺损，对于兔膝关节却是大缺损。负重部位损伤有利于软骨修复。目前实验多在股骨髁负重区钻孔,直径3-6mm深1-3mm(全层或软骨下骨)15、21、4。Sams-AE以3.6104/mm3软骨细胞-胶原修复羊的15mm全层软骨缺损,结果8月修复组织深层是软骨细胞增多的软骨组织,而表层为纤维组织。可能由于大缺损不易修复或细胞数目少。(4)术后活动:组织移植后持续被动活动比自由活动和制动组在成软骨数量,关节表面完整性以及与邻近软骨连接等方面均佳,其再生软骨氨基己糖,硫酸软骨素,II型胶原等均高于其他组29。(5)周围组织预先要准备与修复组织的分子交联（interdigitation），需要高度水化且相对稀释的基质与修复组织基质相配合。否则修复组织终会纤维化，分解。细胞移植后能否与周围软骨及软骨下骨结合，各实验结果不一致，需进一步研究4、15、21。(6)异体移植：软骨细胞抗原性弱，且包埋在基质中不与宿主淋巴细胞和抗体接触，一些异体骨膜和细胞，软骨移植，取得了较好结果15、25。Noguchi T等14比较同系和异系鼠软骨细胞移植，结果同系优于异系。说明免疫排斥仍然是影响移植成功的因素。 细胞移植组织工程为软骨修复提供了新的方法，骨髓未分化间充质细胞取材方便，
