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1、本 科 毕 业 论 文 第页 共页 目 录1 绪论11.1植酸与植酸酶11.2 植酸酶的分类31.3 植酸酶的来源41.4 植酸酶的基本酶学性质61.5 植酸酶的作用机理61.6 植酸酶的应用意义7第2章 植酸酶发酵过程主要影响因素研究92.1 试验材料112.2 试验方法112.3 试验结果与讨论142.4 本章小结25结 论26参考文献27致谢29本 科 毕 业 论 文 第29 页 共30页 1 绪论自从人类畜牧业产生以来，最大限度的发挥家畜的生产潜力和生产价值一直是生产者们和动物营养科学家们共同追求的目标，因此，在配置家畜饲料时，他们从来不考虑家畜营养物质和矿物元素的排泄量，而导致大量的
2、营养物质和矿物元素随动物的粪便排出体外。在广大农村，分散而且低密度的圈养条件下，动物的排泄物是一种非常好的有机肥料，但随着畜牧业大力发展，畜牧业生产集约化的程度大幅度的提高，饲养密度和饲养规模急剧增加，必然导致在较小的面积上产生出大料的排泄物。这些排泄物不得到合理的分散和处理，便会对周围的环境造成严重的污染。猪鸡等家畜，由于是单胃动物，胃中缺乏植酸酶，对植物性饲料中的磷的利用率非常低，为满足单胃动物对磷的需求量，生产中不得不在饲料中添加大量的无机磷，结果大量的未消化的无机磷随动物粪便排泄稻周围环境中，对生态环境造成了很严重的威胁。目前，国内外大量的实验证明，在家畜的饲料中添加植酸酶可以提高家畜
3、对磷的利用率，从而可以减少向环境中排放的磷。植酸酶是一种可作为饲料及食品添加剂的新型酶制剂，可以分解动物饲料中的植酸磷，释放出动物能直接吸收的利用的磷，可以有效减少单胃动物的排便中磷的含量，因此可以减少磷对环境的污染。在饲料中添加少量的植酸酶可以代替添加大量价格昂贵的无机磷酸钙，使饲料成本降低，而饲料的综合利用率提高。植酸酶还能消除植酸对多种金属离子的螯合作用，可以提高动物对植物蛋白和多种矿物元素的利用率以及植物性饲料的营养价值。植酸酶因其多方面的应用特点，植酸酶已成为饲料、医学、人类营养、食品工业、植物生理学和植物育种等领域关注的焦点。1.1植酸与植酸酶1.1.1 植酸磷是动植物的重要元素，
4、作为一种必须的矿物元素在动植物营养中发挥着非常重要的作用磷是动植物核酸、核蛋白和磷脂的重要成分，并与蛋白质的合成、细胞的分裂、细胞的生长有着密切关系。磷是许多辅酶如NAD+、NADP+等的成分，也是ATP和ADP的成分。磷在机体内参与碳水化合物的代谢和运输，如在光合作用和呼吸作用的生理过程中，糖的合成、转化、降解大多数是在磷酸化以后才起反应的。磷对氮的代谢有重要作用，如硝酸还原有NAD和FAD的参与，而磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺则参与氨基酸的转化。磷还与脂肪转化有关，脂肪代谢需要NADPH、ATP、CoA和NAD+的参与。68%-80%的磷在植物性饲料中都是以植酸的方式存在1。植酸( phy ti
5、c acid, 简称PA) 又名肌醇六磷酸, 是维生素B 族的一种肌醇六磷酸酯, 化学名环己六醇- 1, 2, 3, 4, 5, 6- 六磷酸二氢酯。由1分子肌醇和6分子磷酸结合而成，分子式为C6H18024P6，通式为C6H6OP(OH)26分子量为660.8 。植酸广泛以植酸钙镁钾盐存在于植物种子内，是许多植物组织中磷的主要存在方式，占总磷的60%-90% 。植酸对大多数金属离子有极强的络合能力，络合能力与EDTA类似。植酸二价以上金属盐均可定性沉淀2。在饲料中，植物性的饲料含有约1% 4%的磷, 其中60% 80% 的磷通常是以植酸磷的形式稳定的存在于植酸盐复合物中, 这些矿物磷只有在植
6、酸磷被分解游离的情况下才能供家畜吸收及利用, 单胃动物, 如猪和家禽消化道内缺乏植酸酶, 因而对磷的吸收率非常低。另外植酸不仅能够螯合Ca2+ 、Mg 2+ 、Zn2+ 、Fe2+ 等二价金属离子, 降低了矿物质在肠道中的吸收；植酸还能与蛋白质和氨基酸等螯合，抑制体内消化酶的酶活性。植酸的存在大大降低了蛋白质及脂肪物质等营养物质的消化和吸收，使多种微量元素和常量元素的利用率降低,降低了植物性饲料的整体生物作用。1.1.2 植酸酶植酸酶(phytase)，是催化植酸盐及植酸水解成为磷酸和肌醇的一类生物酶的总称，系统名称是肌醇六磷酸酶3，是特殊的酸性磷酸酶，是一种磷酸单脂水解酶，具有特殊的空间结构
7、能水解植酸释放出肌醇和无机磷。在植物性的动物饲料中，大部分的磷酸盐是以植酸的形式存在的。而单胃动物缺少分解植酸的植酸酶。为了改良磷酸盐的生物利用度可以在植物性饲料中添加少量的异种植酸酶，减少植酸的抗营养作用；大量减少无机磷在环境中的排泄，由此可以降低农业生态对环境造成的负担，并且大大减缓了江，河，湖泊及海洋的富营养化；同时也大大减少了动物饲料对无机磷的添加量，然而无机磷是一种不可再生的矿物质资源。为保护环境目前欧洲十几个国家规定不添加植酸酶的饲料不准上市4。1.2 植酸酶的分类1.2.1 基于最适pH 和立体专一性的植酸酶分类植酸化学名为环己六醇- 1, 2, 3, 4, 5, 6- 六磷酸二
8、氢酯5。因植酸分子的特殊立体构象, 植酸酶水解植酸时具有立体专一性，根据立体的专一性, 由国际纯粹与应用化学联合会-国际生物化学与分子生物学联合会(IUPAC-IUBMB)目前承认了三类常见的植酸酶（3-植酸酶、5-植酸酶和6-植酸酶）。3-植酸酶开始水解植酸时首先释放出C3 位磷酸基团, 随后逐渐释放其它的磷酸基团, 5-植酸酶和6-植酸酶分别从C5和C6位开始水解植酸。微生物和植物绝大多数分别产3-植酸酶以及6-植酸酶。最适PH是各种酶的基本属性之一，根据酶活性最适pH值不同，植酸酶也可大致分为两类：酸性植酸酶和碱性植酸酶，酸性植酸酶在pH值5.0左右具有较高活性，碱性植酸酶在pH值接近8
9、.0的时候有较高活性。除了芽孢杆菌和百合花粉外，大部分的生物植酸酶和植物植酸酶都属于酸性植酸酶，为了适应畜禽的胃肠酸性环境, 酸性植酸酶一直受到研究者的青睐和开发，因此酸性植酸酶在饲料和人类食品的适用性中比碱性植酸酶更广泛的底物特异性而被广泛关注。1.2.2 基于结构和催化机理的植酸酶分类按结构的不同，可以将酸性植酸酶划分为有代表性的组氨酸酸性磷酸酶(HAP)-螺旋植酸酶（BPP），紫色酸性磷酸酶（PAP），半胱氨酸磷酸酶植酸酶(CPhy)。 (1)组氨酸酸性磷酸酶（HAP）大多数知名的植酸酶都是HAP，这个类的所有成员都有一个共同的活性位点保守序列RHGXRXP和一个水解磷酸单脂的两步作用的
10、机制。Wyss 和他的同事通过比较几种来源于真菌的植酸酶的水解的特性，提出了 2个类别的HAP 植酸酶：一类底物特异活性比较宽，但是特异活性对植酸的比较低；第二类底物比较窄特异活性，但是比较高特异活性对植酸。（2）- 螺旋植酸酶（BPP）与HAP不同，BPP是最近发现的一类有着特殊水解机制的酶。BPP基因已经从Bacillius subtili和 Bacillus amyloliquefaciens中获得。该分子的三维模型近似于有6个叶片螺旋的基本结构。搜索蛋白数据库，数据显示没有其它的目前已知的磷酸酶具有这种的结构。由于Ca2+的束缚，而具有特定热水解活性和稳定性。BPP有2个束缚位点的磷酸
11、盐，对它的底物的水解出现在邻近的“亲和位点”和“剪切位点”， “亲和位点”加强了对底物亲和力。Ca2+创造了一个有利使束缚变得容易的静电环境。然而，目前与BPP对应的磷酸酶已知的没有，是否在其它的真菌或者细菌中发现还有待于确定。 (3) 紫色酸性植酸酶（PAP）已经从发芽的黄豆种子中分离出来了另一种植酸酶Gmphy。Gmphy 有着活性位点保守序列的紫色酸性磷酸酶。它的水解机制和三维结构已经非常明确了。对基因数据库搜索结果示，在植物，哺乳动物，真菌和细菌中显示了类似于PAP的序列。纯化的Gmphy 的大小估计在7072kda，和其它植物来源的PAP 的分子大小相近。但是Gmphy 是仅知已报道
12、的有较高植酸酶的活性的PAP。（4）半胱氨酸磷酸酶植酸酶(CPhy)目前发现仅存于瘤胃微生物含有半胱氨酸磷酸酶植酸酶。单胃动物因体内缺乏内源性植酸酶所以不能利用植酸。调查厌氧瘤胃微生物时，Yanke 等首先发现一株S. ruminantium 具有植酸酶活性。经过研究表明是一个单体蛋白的植酸酶, 约为46 kD, 最为适应的pH 4.04.5, 最为适应的温度50C55C, 受铁离子等离子的抑制，随后的研究催化机理和蛋白晶体结构揭示这个植酸酶既不属于- 螺旋植酸酶也不属于组氨酸酸性磷酸酶,而是半胱氨酸磷酸酶植酸酶超家族的一种, 它的推断氨基酸序列包含活性部位基元HCXXGXXR (T/S),
13、并且与半胱氨酸磷酸酶植酸酶类群的成员蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosinephosphatase, PTP)具有显着相似性。瘤胃微生物是生活在反刍动物胃肠的一类有益共生菌, 所分泌的植酸酶和纤维素酶等在反刍动物的营养利用中起重要作用。Hong 等利用S. ruminantium植酸酶基因SrPf6 构建的转基因水稻, 其萌发种子在pH 2.06.0 时的植酸酶活性是非转化子的4060 倍, 这为单胃动物饲料开发开辟了新的思路。1.3 植酸酶的来源植酸酶在自然界分布非常广泛，它广泛存在于动物植物组织中，也存在于微生物（细菌，真菌和酵母）。1.3.1 植物植酸酶最早发现的植酸酶是在植物
14、中，大多存在于花粉和种子中，其活性因为种类的差别而又很大不同。如在豆类，谷类，和油料作物，其活力一般都比较低。种子中的植酸酶把植酸磷水解分为无机磷酸盐和肌醇，为种子的发芽及幼苗的生长提供了必要的营养物质。植酸酶最早是在1907年在植物中发现的，因此早期的研究都集中在植物和动物器官上。植物植酸酶分为两种，大部分的植物植酸酶是从肌醇的第六位碳点上开始水解，因此是6-植酸酶，一般存在于植物种子中；另一种存在于植物的组织中，为3-植酸酶。目前已知可从多种植物中分离出植酸酶。1.3.2 动物植酸酶动物植酸酶存在于哺乳动物的红血球和血浆原生质中。但一般而言，动物植酸酶含量较少而且活性低，多胃动物瘤胃微中生
15、物可生产植酸酶，因此可利用植酸盐，单胃动物则难以利用植酸盐。1.3.3 微生物植酸酶微生物来源的植酸酶，1968年，Shine等从68个土样中对2000个菌株进行考察发现，在所得的22株黑曲霉中有21株能产生植酸酶，确定第一个被分离纯化的植酸酶来源于土曲霉。从此以后，陆续从十几种微生物中分离得到植酸酶。微生物植酸酶活性最强的是真菌,特别是Aspergilli 属的真菌。由于动物植酸酶含量非常低，然而植物植酸酶在加工、贮藏等过程中结构易被破坏，而且难以提纯；微生物植酸酶作用范围广泛，较为稳定，规模化生产简单，因此，近几年的研究都集中于微生物植酸酶。产植酸酶的微生物有丝状真菌、酵母和细菌等。就商业
16、化生产植酸酶而言，微生物是最有前景的7。目前，用微生物产植酸酶的工艺主要有固体发酵(sSF) 和液体发酵(sMF) 两种。抉择某一种特定生产工艺时应考虑底物特性、营养素的利用率等、培养条件以及菌株类型因素，这些都是影响发酵产量的重要因素。Stockmann 等报道了在限制氧气的条件下由多形汉逊酵母经液体发酵生产植酸酶，研究数据发现，以葡萄糖作为培养基预先培养菌株在限制氧气的条件下， 使植酸酶的产量提高了大约25%，而且消除了大约20h的发酵延滞期，然而在没有限制氧气条件下通常是存在延滞期的。已有3 种不同的方法可以利用无花果曲霉生产植酸酶，即液体发酵、半固体发酵和固体发酵。但因液态发酵植酸酶生产成本比
