《人工培养冬虫夏草―――百令胶囊诱导淋巴细胞凋亡抑制淋巴细胞增(精)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人工培养冬虫夏草―――百令胶囊诱导淋巴细胞凋亡抑制淋巴细胞增(精)（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、亡抑制淋巴细胞增生【关键词】人工培养【摘要】目的探讨人工培养冬虫夏草百令胶囊免疫抑制作用及作用机制。方法人外周血异基因混合淋巴细胞培养观察百令胶囊对混合淋巴细 胞反应的影响;流式细胞及透视电镜检测淋巴细胞凋亡。上清液测可溶性细胞间 粘附分子T （sICAM-1）及细胞因子IL-10、IL-2、IL-6、IL-10。结果流式 细胞DNA定量分析显示百令胶囊抑制淋巴细胞增殖，并可见凋亡峰（亚G 1 峰）、凋亡比例呈剂量依赖性。透视电镜见百令胶囊组淋巴细胞呈典型凋亡形 态。百令胶囊组 IL-10、IL-6、IL-10 显著减少（P0.001，0.05， 0.002）。百令胶囊高浓度组sICAM-1增
2、加（P0.01），低浓度组sICAM-1降 低（P0.01），与 IL-10、IL-10 改变呈负相关（r=-0.91, -0.99;P0.005, 0.001）。结论人工培养冬虫夏草百令胶囊通过诱导淋巴细胞凋亡，抑制淋巴 细胞增殖。其免疫抑制效应与抑制前炎症因子IL-10、IL-6、IL-10，增加 sICAM-1 相关。关键词冬虫夏草淋巴细胞凋亡细胞因子可溶性细胞间粘附分子-1Suppressive effect of Corbrin， a drug ofcultivated Cordyceps Sinensis， onlymphocyte proliferation by indueti
3、ng apoptosis and regulating cytokines and soluble intercellularadhesion molecule-1 Wang Suya， Chen Jianghua， Zhang Jianguo， et al.Renal Disease Center of the First Affiliated Hospital ofZhejiang University Medical College， Hangzhou310003.【Abstract】 Objective Corbrin capsules， a new pleiotropic immun
4、o-regulator and a capsules of dry powder of cordyceps sinensis which extracted from cultivati on synne-matium by fluid， could induce long-term graft accep 气ance in dog allo- transplantation and were able to replace azathioprine for antirejection therapy in kidney t ranspla ntation patients with uncl
5、ear mechanism of action .Me thods To explore the mechanism of immuno-suppression of the drug of Corbrin capsued.Human peripheral blood lymphocyte were exposed in mixed culture to dry powder of Corbrin with RPMI1640fluid at a series final conce ntration of0.5mg.ml;1.0mg/ml;5.0mg/m l;10.0mg/ml;30.0mg/
6、ml in respectively groups in contrast to the absence of the Corbrin group and to methylprednisolone group for72hours.Cell proliferative cyclewere measured by flow cytometry.While3color flow cytometry and transmission electron microscopy were also evaluated as assay for apoptosis of lymphocyte in vit
7、ro.Invitro-produced pro-inflammatory interleukinlbeta(ILT), IL-2, IL-6, ILTOand soluble int ercellular adhesion molecule-1 (sICAMT)were al_so measured by ELISA tests.Results Lymphocyte proliferation was suppressed.The cell cycle arrested on GI phase.And there was a significant difference in the exte
8、nt of apoptosis in mixed lymphocyte reaction with Corbrin in a dose dependent manner.While in-vitro-production of pro-inflammatory ILTbeta, IL-6, ILTOwere significantly lower than those of blank group (P0.001, 0.05, 0.002, respectively) and IL-2did not change.The sICAMTwere increased in group with C
9、orbrin5.0-30.0mg/ml and decreased in group with Corbrin0.5mg/ml, P0.005, 0.001, respectively) . Conclusion The Corbrin terminating differentiation and inducting apoptosis on activated lymphocytes in a dose dependent has been observed in vitro.The effect of anti-proliferation and immunosuppression of
10、 Corbrin may be related to suppressing of production of ILTbeta, IL-6and IL10and augmenting sICAMTin vitro.Key words cordyceps sinensis lymphocyte apoptosis cytokines soluble intercel lular adhesion molecule-1冬虫夏草具有多重免疫效应1, 2，其免疫抑制作用及其无毒副 作用的特性近年来受到器官移植界的关注，并已用于肾移植临床3, 4。然而对其相关免疫抑制药理机制仍有待深入研究。本课题以人外
11、周血 淋巴细胞为研究对象，对百令胶囊-(CORBRIN CAPSULES,人工培养冬虫夏草菌 丝粉)对异基因混合淋巴细胞反应的影响及对淋巴细胞凋亡、细胞因子及可溶 性粘附分子的影响进行实验研究。1材料与方法1.1药品人工培养冬虫夏草百令胶囊菌丝粉提取液及纯化品由杭州中美华东制药有限公司药物研究所提供。百令胶囊菌丝粉经醇提、水提， 蒸馏水稀释为10mg/ml、100mg/ml高压灭菌-20C低温冰箱冻存备用。1.2试剂RPMI-1640 （SIGMA）培养液，含10%灭活小牛血清（四季青生 物工程技术研究所，杭州），L-谷酰胺（2mmol/L），青、链霉素各100U/ml, pH 调至 7.0。
12、IL-10、IL-2、IL-6、IL-10（ELISA）试剂盒（COULTER 公司， 购自法国），sICAM-1（ELISA）试剂盒（CATALOG公司，购自比利时）1.3人外周血单个核细胞（PBMC）分离与异基因淋巴细胞双向混合培养 （MLC）三组同型健康人外周血分别肝素抗凝，淋巴细胞分离液密度梯度离心 分离PBMC，PBS充分洗涤，计数，RPMI1640配成淋巴细胞悬液，加入药液，多 块24孔培养板双向混合培养，37C（5%CO 2 ） 72h。细胞浓度为5X10/ml。1.4实验分组百令胶囊各浓度组（简称“百令各浓度组”）：分为终浓度 0.5mg/ml 组、1mg/ml 组、5mg/m
13、l 组、10mg/ml 组、30mg/ml 组。百令胶囊菌丝 粉浓度以1640液稀释调配，0.2卩m滤过器滤过。百令胶囊总组（简称百令总 组）：各浓度百令胶囊组总和。甲基强的松龙组（MP组）：终浓度2X10 -3 mol/L;FTY720组:终浓度5mg/ml:对照组加同等量 1640液。每组均为3复孔。1.5凋亡（Apoptosis）相关检测1.5.1 Apoptosis形态学观察2%戊二醛及10%小牛血清先后将淋巴细胞固 定成团块状，Epon812包埋，超薄切片，透视电镜下观察细胞形态。1.5.2 Apop to sis DNA定量分析PBS洗涤PBMC，无水乙醇固定为单细胞悬液，PBS洗
14、 涤，加入 Rnase （终浓度 0.1mg/ml），100l，37C，25min，加 PI （碘化丙 啶，终浓度50g/ml）染色30min，上机检测。流式细胞仪（B-D公司， FACScan型）DNA定量分析。1.6淋巴细胞增殖周期测定 流式细胞仪DNA定量分析测定淋巴细胞增殖 周期。1.7细胞因子及sICAM-1检测 淋巴细胞培养上清液ELISA法测细胞因子 IL-10、IL-2、IL-6、IL-10 及可溶性 ICAM-1 （sICAM）1.8统计学处理 流式细胞仪监测指标Multicycle软件拟合分析。计量资 料以x土s表示，两组间均值比较米用t检验。P0.05为差异有显著性， P
15、0.01为差异有非常显著性。2结果2.1百令胶囊抑制淋巴细胞增殖百令总组G 0 /G 1期明显高于对照 组，P0.001;S期低于对照组，P0.02;G 2 /M期低于对照组，P0.001，见表 1。2.2百令胶囊诱导人外周血淋巴细胞凋亡 流式细胞DNA定量分析显示 百令胶囊各组与MP组、FTY720组均出现凋亡峰（亚G 1峰）。百令胶囊各组 凋亡比例呈剂量依赖性（图18）。2.3透视电镜下淋巴细胞显示典型凋亡特征性变化凋亡细胞体积变 小，细胞质浓缩，细胞核变小裂解，产生凋亡小体（图912）。2.4细胞因子改变 百令胶囊总组IL-10低于对照组，P0.001;高于MP 组，P0.05;IL-6
16、低于对照组，P0.05;IL-10低于对照组，P0.002，（见表 2）。IL-2与对照组差异无显著性。表1百令胶囊对淋巴细胞增殖周期的影响（略）百令胶囊各组sICAM-1改变与IL-10、IL-10负相关，r=-0.91;- 0.99;P0.005, 0.001。3讨论器官移植进入后环抱素A （CSA）时代，移植临 床寻求协同性更好，毒副作用更小，对免疫及非免疫性炎症均有作用的免疫抑 制剂。冬虫夏草是一种寄生于虫草蝙蝠蛾子座及幼虫尸体的复合物，具有多重 免疫调节作用。已有的资料显示，冬虫夏草可抑制小鼠脾细胞对ConA及LPS的 增殖反应2;小鼠同种异体移植皮片2及小鼠移植肾存活时间显著延 长3;用于同种异体人肾移植可替代硫唑嘌吟为免疫抑制剂4。本课题人外周血异基因混合淋巴细胞培养显示百令胶囊组淋巴细胞G1 期显著延长。G 1期为DNA合成前期，是细胞质复制的
