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1、分子生态学研究方法与技术在环境微生物领域的应用 （专业：09微生物 姓名：柴化建 学号：s9071005478） 摘要：对环境微生物的研究有助于利用环境微生物解决环境污染的问题。微生物是废水处理、城市生活垃圾填埋或堆肥处理等系统中的主要功能生物，充分认识其中的微生物学原理能为改进处理工艺、提高处理效率提供依据。通过利用分子生态学的研究方法和技术，从分子的活动变化规律来闸释环境微生物生态变化及生物分子活动过程与机理，从而应用于环境治理领域。关键字：环境微生物 荧光杂交 蛋白质组学 宏基因组学 微阵列 环境在不同的生命层次（分子水平，个体水平，种群水平，及群落水平，甚至生态系统水平）对生命活动产生
2、不同的影响，生物体也是通过在不同水平层次上的调节来适应和改变环境。 在环境微生物领域，对环境中微生物的主要类群及它们的生理、生态特性、微生物与环境污染的关系、污染物的微生物降解及转化规律等进行研究是重要的。目前研究环境微生物的主要方法仍是基于培养和分离纯化的传统技术，已经无法满足研究者对环境微生物进行快速、准确的分析与鉴定的要求。故从分子生态学方向入手将会给环境微生物的研究起到很大的推动总用。分子生态学应用分子生物学的原理和方法来研究生命系统与环境系统相互作用的生态机理及其分子机制。从微观研究层次它主要涉及生态现象与生态规律的发生、演化与发展的分子生物学过程与机理，即怎样利用DNA(基因)，蛋
3、白质(酶)等生物活性分子的活动变化规律来闸释生态变化的生物分子活动过程与机理。利用分子生态学研究方法与技术，从分子种群生物学、分子环境遗传学和分子适应等几个方面的内容对环境微生物进行研究。以求改进微生物处理污染物的工艺、提高处理效率。一环境mRNAandrRNA同时荧光原位杂交 Giovannoni等在1988年首次将荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybirdization，FISH)引入细菌学的研究，当时使用的是放射性标记rRNA寡核苷酸探针来检测微生物。随着荧光标记的发展，放射性标记被非同位素染料代替。1989年，DeLong首次使用荧光标记寡核苷酸探针检测单个微生物细
4、胞，荧光标记寡核苷酸探针比放射性探针更安全和具有更好的分辨力，并且不需要额外的检测步骤。荧光原位杂交是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪(confocallaserscanningmicroscope，CLSM)下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA或RNA分子在染色体或其它细胞器中的定位。由于rRNA在微生物体内的拷贝数较高、分布广泛、功能稳定，而且在系统发育上具有适当的保守性，因此通常使用rRNA作为探针，但以rRNA作为探针的FISH只能分析群落的遗传结构，
5、不能明确揭示群落结构与功能的关系。Anneliepernthaler等将rRNA和mRNA同时FISH来研究环境细菌结构和某一代谢活性之间的关系，作为一个例证研究，同时检测环境微生物mRNA和rRNA，他们研究了pmoA(编码甲烷单氧化酶A亚基)基因的在环境中的表达，很好地与群落功能活性联系起来。可见，将环境rRNA和mRNA同时FISH来研究微生物群落功能是可行的。FISH技术可确定细胞和组织中特异性转录物定位及其表达的相对水平，它是用一标记生物素或地高辛的非同位素探针，和所制备样本中的RNA进行杂交。地高辛内标记的反义多聚核苷酸探针，在反转录过程中杂交到细菌细胞中，这一技术将是研究复杂群落
6、环境中原位基因表达较为有利的手段。另外，结合报告基因分析的FISH技术对于复杂微生物群落的结构与功能分析也是十分方便有利的。在微生物群落研究中利用FISH技术将原位杂交与功能研究结合是必然的发展趋势，可以进行基因表达和代谢水平的研究。二稳定性同位素联合宏基因组技术 宏基因组(metagenomics)或环境基因组(environmentalgenomics)是特定环境内所有生物遗传物质的和，是一种不依赖于人工培养的微生物基因组分析技术。它于1998年首先由Handelsman等提出，与传统方法相比，宏基因组学是一种不依赖于纯培养(cultivationindependent)的技术方法。它直接
7、从环境样品中提取基因组DNA(environmentDNA，eDNA)，以获得某一环境或共生体中所有微生物基因组的集合，然后将环境eDNA克隆到适当的载体上，通常是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)和不同类型的广宿主或穿梭载体然后让其在大肠杆菌、链霉菌、假单胞菌或根瘤菌等适宜宿主中表达H，构建一个复杂度极高的宏基因组文库，最后运用各种分析手段筛选出功能基因，并可以进一步对功能基因测序，推测活性产物的结构，建立系统发生树等。宏基因组技术能够基于序列分析得到微生物群落潜在生态功能信息，但是，不能够明确预测功能特别是在特异条件下才表达的基因。而且要从由环境复杂群落构建的宏基因组文库中获得特定的目标
8、基因需要筛选和测序成千上万的克隆。尽管通过宏基因组学的方法筛选到了一些功能基因，但随机性太大。稳定性同位素联合宏基因组技术(SIPenabledmetagenomics)可大大减少克隆的数量。通过稳定性同位素(SIP)实验使参与特定代谢过程(例如甲烷氧化)的生物基因组得到富集，克隆从SIP实验中获得的”C标记的核酸，从而构建出在某一特定的环境过程中执行特定代谢功能(如可吸收或转化、代谢特定的标记基质)的环境微生物的功能宏基因组文库，就可重建一个较小、针对性强的目标微生物功能群基因组，从而极大地减少需要筛选的基因克隆数量。并且可直接利用分离出的”C一核酸构建宏基因组克隆文库。稳定性同位素联合宏基
9、因组技术可用于环境甲基营养菌(甲烷营养菌和甲醇营养菌)、有机污染物降解菌、根际微生物生态(植物微生物微动物相互作用)、厌氧环境中互营微生物等群落结构和特定代谢过程功能分析，在微生物的种类鉴定和功能鉴定间建立了直接的联系。三微阵列技术 微阵列技术自1995年由Schena创立以来J，已逐渐发展成为功能基因组学研究的最有力的工具之一。它作为一种强有力的基因技术，被广泛地用于研究生物过程。虽然微阵列技术已被成功用于分析纯培养全基因的表达，但是由于特异性、灵敏度和定量等问题，它在环境微生物群落研究中仍存在挑战。根据探针的类型可将环境研究中的微阵列分为3类：功能基因微阵列(functionalgenea
10、rrays，FGAs)、群落基因组微阵列(communitygenomearrays，CGAs)和系统发育寡核苷酸微阵列_9J。其中，功能基因微阵列以代谢途径中关键基因作为探针，研究微生物群落中的功能菌群在环境中的功能活性及其代谢途径。为了构建含有大片段DNA的FGAs，需要通过PCR方法从环境样品的克隆中扩增制备探针，因此，对于得到不同环境样品的克隆仍具有挑战性。由于寡核苷酸微阵列特异性高，便于构建，它可能是微生物生态学研究的重要方法。不过，虽然它在环境微生物群落功能研究中大有希望，但是这种微阵列技术并未得到严格的测试和环境中应用的验证Rhee等发展了一个50个碱基的寡核苷酸微阵列技术，用来
11、自2402个已知的生物降解和重金属抑制有关基因中的1657个探针研究了环境群落生物降解潜力和功能活性。结果证实50个碱基的寡核苷酸微阵列开发为微生物群落功能研究提供了新的快速、强大、高通量分析工具，可用于监测生物修复潜力及功能活性微阵列技术已广泛应用于研究废水处理系统以及环境污染物中微生物参与的反应和调节过程和机制、养物循环和富营养作用的微生物多样性、微生物生态学原理以及生物学过程中与环境胁迫反应相关的基因能和调节控制研究，并建立了基因表达谱，特别是寡核苷酸微阵列是当前环境微生物群落功能研究中的一有效手段。四环境蛋白质组技术 蛋白质组是一个细胞或组织所表达的全部蛋白质组分。现在比较公认的概念是
12、，在一种细胞内存在的全部蛋白质组分。对于微生物群落来讲，蛋白质组学是对生物系统中所有蛋白的综合分析，能够揭示遗传信息是怎样转变为微生物群落功能的多样性。在后基因组时代，微生物群落分析的一个主要的挑战就是阐述宏基因组的功能，并把微生物群落遗传结构和它们的功能多样性联系起来。除前面所述的环境mRNA和rRNA同时荧光原位杂交和稳定性同位素联合宏基因组技术外，微生物群落功能也能通过转录组学(Metranscriptome)的方法研究，即提取环境样品中的所有微生物的RNA，构建16SrRNA基因克隆文库或cDNA文库，再做进一步研究。然而，由于RNA的半衰期较短，在抽提过程中难以去除腐殖质，相似基因在
13、不同群体中有不同的转录动态，RNA和蛋白质的低相关性，这些阻碍了Metranscriptome在土著微生物群落研究中的应用。正是这些限制，才使蛋白质组学的方法逐步在微生物群落研究中开始得到应用。环境蛋白质组学(Metaproteomics)最初由Wilmes和Bond命名，指大规模鉴定给定时间和地点的环境样品的整个蛋白组分。基本程序包括：环境中总蛋白的提取、通过一维或二维凝胶电泳对蛋白进行分离、质谱分析、数据统计分析将群落遗传结构与功能结构联系起来，同时也可鉴定蛋白进行反向遗传学研究。Wilmes和Bond成功地抽提和纯化了来自优化的生物除磷活性污泥的总蛋白，采用二维聚丙烯酰氨凝胶电泳进行分离
14、和蛋白指纹图谱分析，并将高表达的蛋白质点进行切除，确定了以四级杆飞行时间质谱从头多肽测序，分离的蛋白质分别被鉴定为外膜蛋白(porin)、乙酰辅酶A乙酰转移酶和ABC型支链氨基酸运输系统蛋白组分，这些蛋白可能来自于活性污泥中尚未纯培养的积累磷酸盐的微生物。这是将蛋白质组学方法用于研究水生微生物群落。自然界的微生物群落是极其复杂的动态系统，在后基因组时代，基于核酸分析的方法(不能够揭示微生物群落的原位功能。大规模研究土著微生物表达蛋白(Metaproteome)能提供微生物在生态系统中的功能信息，它有望把微生物群落的遗传和功能多样性联系起来，更具体地说，对于不同环境的Metaproteomics
15、的分析：(1)可以捕捉新的功能基因和代谢途径；(2)鉴定与特异胁迫有关的蛋白。蛋白质组学联合宏基因组数据可以更好地揭示环境群落分类多样性、功能多样性和生物过程。五面临的问题和展望 荧光原位杂交技术在微生物群落分析上有一定的应用，但是也存在许多缺陷和干扰因素：如许多霉菌、酵母菌和细菌(如假单胞菌属、军团菌属)会有自身荧光，干扰荧光信号强度；在群落分析时，探针缺乏特异性等。微阵列技术由于实验条件的限制，不能被广泛接受。尽管宏基因组技术从提出到现在已经在一定程度上得到了广泛应用，发现了一些功能基因，但是就这项技术本身仍存在许多限制：(1)环境DNA的提取仍旧需要改善，没有一个统一的核酸提取程序，针对
16、不同的环境样品，需要摸索不同提取条件，以提高提取DNA的纯度，进一步满足构建文库的需要；(2)克隆的表达效率非常低；(3)需要构建大片段宏基因组文库以提高筛选完整功能基因簇的效率。环境蛋白质组学刚刚开始得到应用，环境蛋白质的提取和纯化需要不断的完善，为后续的分离和蛋白的鉴定提供条件。将环境基因组学和蛋白质组学联合来研究微生物群落功能或许较为可行，可以将群落组分与功能联系起来。微生物群落对环境有着非常重要的意义。迄今，用分子生物学的方法来研究群落主要集中在鉴定物种，即微生物群落结构的遗传结构分析，宏基因组学只能提供潜在的功能，几乎没有能力去证实原位功能。蛋白质组学有潜力研究群落的功能信息，但微生物群落的蛋白质组学正处在萌芽状态，需要不断地改进技术问题。技术上的联合是必要的，例如荧光原位杂交和宏基因组的联合，稳定性同位素技术与宏基因组的联合，基因组与蛋白质组的联合等。随着技术的不断完善，微生物群落功能研究必将迈出新
