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1、食品微生物学实验、实训指导 食品教研室、生物教研室组织编写(内部使用)漯河职业技术学院轻工系食品加工技术专业使用2006年12月实验室安全守则1.进入实验室工作衣、帽、鞋必须穿戴整齐。2.在进行高压、干燥、消毒等工作时，实验人员不得擅自离开现场，认真观察温度、时间，蒸馏易挥发、易燃液体时，不准直接加热，应置水浴锅上进行。3.严禁用口直接吸取药品和菌液，按无菌操作进行，如发生菌液、病原体溅出容器外时，应立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方能离开现场。4.实验完毕，两手用清水肥皂洗净，必要时可用（杀菌剂）新洁尔灭、过氧乙酸液浸泡手，然后用水冲洗，工作服应经常清洗，保持整洁，必要时高压消毒。5
2、.实验完毕，及时清理现场和实验用具，对染菌带毒物品，进行消毒灭菌处理，并填写日常工作记录。6.每日实验结束，认真检查水、相关电源是否关闭和正在使用的设备运转是否正常，并认真记录。关好门窗，方可离去。实验室检验总则一、样品的采集（一）采样目的确保采集的样品能代表全部被检验的物质，使检验分析更具代表性。（二） 采样原则1.采集的样品要有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在，同时能反映全部被检食品的组成、质量和卫生状况。2.应设法保持样品原有微生物状况，在进行检验前不得污染，不发生变化。3.采样必须遵循无菌操作程，容器必须
3、灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，新洁尔灭、酒精等消毒物灭菌，更不能含有此类消毒药物，以避免杀掉样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可使用。（三）采样数量取样数量的确定，应考虑分析项目的要求、分析方法的要求及被检物的均匀程度三个因素。样品应一式三份，分别供检验、复检及备查使用，每份样品数量一般不少于200g。根据不同种类采样数量略有不同，实验室检验样品一般为25克。（四）采样方法1采取随机抽样的方式。2直接食用的小包装食品，尽可能取原包装，直到检验前不要开封，以防污染。3 如为非冷藏易腐食品，应迅速将所采样品冷却至04。4不要使样品过度潮湿，以防食品中固有的细菌增殖。
4、5在将冷冻食品送到实验室前，要始终保持样品处于冷冻状态。样品一旦融化，不可使其再冻，保持冷却即可。（五）样品的保存和运送1样品采集完后，应迅速送往实验室检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在15环境中，如需冷冻者，则在冷冻状态下送检。2冷冻样品应存放在15以下冰箱内；冷却和易腐食品应存放在05冰箱或冷却库内；其它食品可放在常温冷暗处。3运送冷冻和易腐食品应在包装容器内加适量的冷却剂或冷冻剂。保证途中样品不升温或不融化。4待检样品存放时间一般不应超过36小时。二、检验样品的制备（一）样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。（二）检验冷冻样品前应先使其融化。可在04融化，时间不超过1
5、8小时，也可在温度不超过45的环境中融化，时间不超过15分钟。（三）检验液体或半固体样品前应先将其充分摇匀。如容器已装满，可迅速翻转25次；如未装满，可于7s内以30cm的幅度摇动25次。从混样到检验间隔时间不应超过3min。(四)开启样品包装前，先将表面擦干净，然后用75乙醇消毒开启部位及其周围。1非粘性液体样品可用吸管吸取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基内，吸管插入样品内的深度不应超过2.5cm,也不得将吸有样品的吸管浸入稀释液或培养基内。2粘性液体样品可用灭菌容器称取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基。 3.固体或半固体样品可用灭菌的均质杯称取一定量，再加适量的稀释液或培养基进行均
6、质，从样品的均质到稀释和接种，相隔时间不应超过15分钟。三、检验（一）实验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责，严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。（二） 检验所使用的稀释液、试剂、培养基接触的一切器皿必须经过有效的灭菌。（三）实验室所用仪器、设备的性能应定期检查和校正。（四）制备试剂和培养基所用的水，应为无离子水或用玻璃器皿蒸馏的蒸馏水。（五） 检验结束后，所有带菌的培养基、试剂、稀释液和器皿必须尽快灭菌和洗刷。清洗过的器皿不应残留洗涤剂的痕迹。四、检验记录和结果的报告（一）经检验的每份样品都应有完整的检验记录。样品检验过程中所用方法、
7、出现的现象和结果等均要用文字写出试验记录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。（二） 检验结束后，根据检验结果，及时填写检验报告书，签字并经负责人审核签字后发出。 实验一 普通光学显微镜的构造和使用一、目的与要求（一）学习普通光学显微镜的结构、各部分功能及使用方法。（二）学习并掌握油镜的原理工科使用方法。二、原理普通光学显微镱由机械装置和光学系统2大部分构成。在光学系统中，物镱的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜中配置的几种物镱以油镱的放大倍数最大，与其它物镜相比，使用较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，以增加照明亮度和提高
8、分辨率。三、材料与仪器（一）菌种 金黄色葡萄球菌及枯草杆菌染色玻片标本，啤酒酵母水浸片。（二）其他 香柏油、二甲苯、显微镱、擦镜纸。四、操作步骤（一）显微镜的安置 置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘34cm，镱检时姿势要端正。（二）调节光源 安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镱采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜度调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。（三）低倍镜观察 将标本玻片置于载物台上，用标本夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方，下降10物镜，使其接过标本，用粗调节器（粗调螺旋）慢慢升起
9、镜筒，出现图像后再用细调节器（细调螺旋）调节图像至清晰。通过标本夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适目的物，仔细观察。（四）高倍镜观察 在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，以聚光镜器光圈及视野进行适当调节后微调细调节器使物象清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录。（五）油镜观察 在低倍镜或高倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高约2厘米，然后在待观察区域滴加12滴香柏油，将油镜转到工作位置，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，将聚光器升至最高位置并开足光圈，用粗调节器将镜筒徐徐上升，
10、直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰为止。（六）显微镜用后处理1、上升镜筒，取下载片。2、用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹，然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。3、用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。4、将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八字形”再向下旋，同时把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。五、实验报告（一）结果 分别绘出在不同物镜下观察到的不同的菌种的形态，同时注明放大倍数。（二）思考题1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？2显微镜中调节光线强弱的装置有哪些？ 实验二 细菌的简单染色和革兰
11、氏染色一、目的与要求（一）掌握染色的原理和操作过程（二）掌握简单染色和革兰氏染色法（三）熟练显微镜的使用技术二、原理由于菌体极小，折光率低，在显微镜下不容易看清，如将其染色，使菌体和背景之间反差增大，折光率增强，就容易看清，简单染色法只用一种染料着色。革兰氏染色法是细菌染色中一种重要的鉴别染色法。通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。其过程是：草酸铵结晶紫初染路哥尔氏碘液媒染95%乙醇脱色蕃红花红复染。若细胞能保持结晶紫与碘所形成的复合物而不被乙醇脱色，则细菌呈紫色，称革兰氏阳性菌，若被乙醇脱色而被蕃红复染成红色，则称革兰氏阴性菌，三、材料与仪器（一）革兰氏染色液（草酸铵结晶
12、紫液路哥尔氏碘液95%乙醇蕃红花红）、蒸馏水、菌落培养物（培养1824小时）、二甲苯、香柏油（二）载玻片、盖玻片、酒精灯、废液缸、洗瓶、吸水纸、接种环、显微镜、镊子（三）金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（1216h），大肠杆菌。四、操作程序（一）简单染色法 涂片干燥固定染色水洗干燥镜检1涂片 取洁净载玻片，在中央滴一滴生理盐水（或无菌水），用接种环以无菌操作挑取欲观察菌体，和水充分混匀，涂成极薄的菌膜。2干燥 室温自然干燥或略微加热干燥。3固定 涂面朝上，快速通过火焰23次（勿使涂片烫手）。4染色 放平染料，用自来水冲洗，直到涂片上流下的水无色为止。6干燥 自然干燥或吸水纸吸干，或用电吹风吹干。（
13、二）革兰氏染色法涂片干燥固定草酸铵结晶紫初染水洗碘液媒染95%酒精脱色2030秒水洗蕃红花红液复染水洗干燥镜检1涂片：先滴一小滴蒸馏水于载玻片中央，然后用接种环取少量菌体轻轻混入水中，涂成一薄层并使细胞均匀分散。2干燥：在空气中令其自然干燥或在酒精灯火焰上端高处微微加温但勿靠近火焰。3固定：把涂有细菌的面朝上，在酒精灯火焰上通过三次，目的是杀死菌体细胞以及改变对染色剂的通透性，同时使涂片的菌体紧贴载玻片而不易被水冲洗脱落。4初染：用草酸铵结晶紫液初染1min，水洗、吸干。5媒染：加一滴路哥尔氏碘液媒染1min、水洗。（此时结晶紫与碘液成复合物）6脱色：斜置载玻片，用95%酒精冲洗约2030s，
14、立即水洗，吸干。7复染：用蕃红花红液复染12min，水洗晾干或用吸水纸吸干。8镜检：在显微镜油浸镜下检查革兰氏阳性菌和阴性菌染色的差异，并观察菌体形态。（三）革兰氏染色成败的控制点1涂片厚度：涂片过厚，细胞重叠，无法较好地观察单个细菌细胞形态，涂片过薄，细胞数量少，不利于观察；2染色时间。染色时间过长,结晶紫与细胞结合，脱色不易，染色不够，结晶紫尚未与细胞结合。染色控制不好，易引起误判；3乙醇脱色的程度。如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够，则阴性菌被误染为阳性菌。五、实验报告（一）结果 说明3株细菌的染色观察结果（形态、颜色革兰氏染色结果）。（二）思考题1你认为制备细菌染色标本时，
15、应注意哪些环节？2哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 实验三 酵母菌形态观察 一、目的与要求观察酵母菌的形态及出芽繁殖方式。二、原理大小通常比细菌大几倍甚至十几倍，大多数的酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的二分裂繁殖。用美兰制成的水浸片，可观察酵母的形态和出芽繁殖方式以及进行死活细胞的鉴别（染成蓝色的为死细胞，无色的为活细胞）。三、材料与仪器（一）啤酒酵母、假丝酵母、汉逊酵母。（二）显微镜，载玻片、盖玻片、接种针、酒精灯。（三）吕氏美蓝染液。四、操作步骤（一）在干净载玻片中央加一滴吕氏染色液，以无菌操作用接种环挑取少量酵母菌体放于美蓝液中，混合均匀。（二）取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下（以
