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1、高效稳定纤维素分解菌群的筛选及其特性研究王得武1，姚 拓2，杨巧丽1，韩华雯2，张 英2，卢 虎2，滚双宝1*（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2. 甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070）摘要：为获得能够在常温条件下（2835）快速分解纤维素的微生物群体，以限制性培养技术从牛、鸡粪混合储粪池土样筛选了一组纤维素分解菌群，利用失重法测定了该菌群对不同纤维材料的分解能力，并采用固体平板技术对其菌株组成及其特性进行了研究。结果表明，筛选的纤维素菌群48 h可将培养基内滤纸分解成糊状；6 d对滤纸、玉米秸杆、稻草秸杆、小麦秸杆、柞木木屑和杨木木屑分解率分别为94.
2、95、48.52、45.05、44.30、11.00、1.22；在发酵液初始 pH 511的范围内，对滤纸分解率超过84.59，并将反应体系pH最终调节稳定在8.58.8；经分离纯化得到的8株真菌、6株细菌和3株放线菌相互接种构建的人工菌群不具备纤维素分解能力。纤维素分解菌群能够高效分解纤维素，对秸杆类木质纤维素也具有很强的分解能力。关键词：纤维素分解菌群；纤维素分解；木质纤维素；pH纤维素是地球上分布最广，含量最丰富的可再生资源，广泛存在于园林、秸秆、畜禽粪便等有机固体废弃物中1,2，当前这些资源利用率极低，在浪费能源的同时对环境造成了污染。利用微生物技术是实现这些废弃物资源化和解决环境问题
3、的一种有效途径。目前应用和研究的纤维素分解菌多为单菌株，如工业生产纤维素酶的微生物菌种大多都是丝状真菌，然而单菌株往往存在纤维素酶系不健全、酶活不稳定、酶作用pH范围狭窄及产酶成本高等问题，对纤维素分解能力有限3,4。自然界中，纤维素在多种微生物共同作用下被分解从而进入地球的碳素循环，多种微生物的协同作用在纤维素分解过程中非常重要。因此，近年来微生物群体功能的研究越来越受到关注2,5-8。崔宗均等2,5,6利用限制性培养技术和优化组合方法，培养出了高温条件下具有很强活力的纤维素复合菌系，但在常温条件下受到一定的限制。本研究以畜禽粪便储粪池中土样为原材料，筛选出了一组在常温条件可高效降解纤维素的
4、微生物群体，并对该菌群的木质纤维素分解能力、不同pH环境下的适应能力及其菌株组成进行了研究，以期为其进一步研究与推广应用提供理论依据与技术支持。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种来源 森林腐殖质、腐烂的玉米秸杆、牛场料槽旁边土样、麦垛底部土样和牛鸡粪混合储粪中土样。1.1.2 培养基 蛋白胨5 g，酵母膏5 g，纤维素（新华滤纸）5 g，NaCl 5 g，CaCO3 2 g，K2HPO4 1 g，MgSO47H2O 0.5 g，FeSO47H2O 0.5 mg，MnSO4H2O 0.16 mg，ZnSO47H2O 0.16 mg，CoCl2 0.2 mg，加蒸馏水至1000 mL，pH
5、 7.0，121灭菌25 min。1.1.3 纤维材料 滤纸以1%醋酸浸泡过夜后，用蒸馏水反复浸泡洗至中性，80烘干备用。秸杆和木屑粉碎过1 mm筛，蒸馏水煮沸十分钟，以三层沙布过滤冲洗，80烘干恒重后备用。1.2 纤维素分解菌群筛选 取5 g土样接入100mL培养基内培养，命名为第1代，待培养液中滤纸分解至不再明显变化，取菌液5 mL接入新鲜培养基内，重复接种，接依次为2、3、4n代。根据滤纸条的断裂程度判断降解效果：（+）滤纸边缘膨胀；（+ +）为滤纸边缘不定形；（+ + +）滤纸整体不定形；（+ + + +）滤纸成团糊状；（+ + + + +）滤纸完全成糊状。培养过程中，淘汰分解能力不稳
6、定及分解能力退化的菌群。培养条件：2835，80 r/min微震。1.3 纤维素分解菌群对不同纤维材料分解能力测定分别以0.5 g的滤纸、玉米秸杆、稻草秸杆、小麦秸杆、柞木木屑和杨木木屑为培养基唯一碳源制作100 mL培养基，接种5 mL纤维素分解菌群，培养条件同1.2，6 d后测定不同纤维材料的分解量（失重量），计算分解率（失重率），具体方法如下：参考测定饲料粗纤维使用的尼龙袋技术9及测定土壤纤维分解强度使用的尼龙网袋法10，利用38 m尼龙袋过滤培养基，再用蒸馏水冲洗，烘干，称量，恒重，计算。纤维材料分解率（纤维材料原质量+尼龙袋质量烘干后纤维材料与尼龙袋质量和）/纤维材料原质量100%。
7、1.4 纤维素分解菌群对不同初始pH值培养基pH的影响及滤纸分解能力测定以滤纸为培养基唯一碳源制作100 mL培养基，将培养基初始pH值调至5、6、7、8、9、10、11，分别接种5 mL纤维素分解菌群，培养条件同1.2，每隔12 h测定培养基pH值，并观察培养基滤纸崩溃的情况，待培养基pH值稳定后测定滤纸分解量，计算分解率，测定方法同1.3。1.5 纤维素分解菌群单菌株分离及单菌组合后对滤纸分解能力测定培养基加入1.5%的琼脂制作固体培养基，取纤维素分解菌群用生理盐水稀释至10-5、10-6、10-7分别涂平板。将涂好的平板放入32培养箱内培养3 d，培养好氧菌；将涂好的平板装入厌氧袋，真空
8、抽气1 min，再充氮气1 min，反复操作3次，将厌氧袋封口，置于32培养箱内5 d培养兼性厌氧菌。根据平板培养基上菌落形态差异，多次划线分离直至纯化为单菌，对分离的单菌株相互组合接入以滤纸为唯一碳源的培养基，培养6 d测定滤纸的分解率，测定方法同1.3。1.6 数据分析 采用Microsoft Excel 2003软件对数据进行处理和绘图，采用SPSS 11.5统计分析软件对数据进行统计分析.2 结果与分析2.1 纤维素分解菌群的筛选由表1可以看出，以森林腐殖质、腐烂的玉米秸杆、牛场料槽旁边土样、麦垛底部土样作为原材料，传代过程中培养基中滤纸有变软、边缘崩溃迹象，但始终不能彻底分解滤纸，至
9、第10代，淘汰以上述材料筛选的菌群。从牛、鸡粪混合储粪池中的土样筛选的菌群，第1代培养基中滤纸240 h完全崩溃，第2代培养基中滤纸120 h完全崩溃，第3代培养基中滤纸72 h完全崩溃，从第6代以后，滤纸崩溃时间逐步稳定到第48 h左右，经过30代培养，获得了一组高效、稳定的纤维素分解菌群（图1）。表1 不同材料所筛菌群对滤纸的分解效果Table 1 Filter paper decomposition of isolated microbial community from different materials菌种来源Strains source第1代 Generation 1第5代 G
10、eneration 5第9代 Generation 9降解效果Degradation effect时间Time（h）降解效果Degradation effect时间Time（h）降解效果Degradation effect时间Time（h）牛鸡粪混合储粪池cattle and chicken feces compost+ + + + +240+ + + + +50+ + + + +48原始森林腐殖质Primeval forest humus+ + +240+ + +120+ + +120腐烂的玉米秸杆Rotten corn straw+ +240+ +120+ +120牛场料槽旁边The si
11、de of trough at cattle farm+ +240+ + +120+ + +120麦垛底部The bottom of wheat-rick+ +240+ +120+ +120图1 不同代纤维素菌群对滤纸的分解效果Fig.1 Effects of different culture times on filter paper decomposition in cellulose microbial community 注：图中标注时间为滤纸崩溃成糊状所需时间。 Note: The marked time in figure were the degradation time of
12、 filter paper into paste completely.2.2 纤维素分解菌群对不同纤维材料分解力 分解率与绝对分解量是反映菌群分解潜力的重要指标。纤维材料不同，分解强度差异较大，纤维素分解菌群6 d分解滤纸0.47 g，分解率达94.95%，显著高于其它纤维材料的分解量及分解率，对秸杆的分解能力居中，6 d分解率为45%左右，对柞木木屑和杨木木屑分解率则较低，6 d分解率分别为11.00%和1.22%（表2）。可见纤维素分解菌群对纯纤维素材料有分解能力极高，对秸杆类木质纤维素材料也有较高的分解能力，而对木材类木质纤维原料分解能力较差。 表2 纤维素菌群对滤纸、秆秸、木屑的分解
13、能力Table 2 Degradation activity of filter paper, straw, and sawdust by cellulose composite microbial strains材料Material分解量 Decomposition value（g）分解率 Degradation ratio（%）滤纸Filter paper0.470.009 a94.951.67 a玉米秸杆Corn straw0.240.005 b48.521.06 b稻草秸杆Rice straw0.230.004 c45.050.76 c小麦秸杆Wheat straw0.220.005
14、c44.301.08 c柞木木屑Xylosma0.060.007 d11.002.21 d白杨木屑Poplar wood chips0.010.005 e1.220.93 e 注：表中不同小写字母表示差异显著（P0.05），下同。 Note：Different lowercases in the table mean significant difference at 0.05 level, The same below.2.3 纤维素分解菌群对不同初始pH值培养基pH的影响及滤纸分解能力分别对pH 511的培养基接种后，第24 h培养液的pH集中到8左右，之后的72 h内pH值在7.59.2
15、范围内轻微波动，最终稳定在8.58.8之间（图2）。说明纤维素分解菌群在初始pH为511的条件下适应能力极强，并能够快速调节并稳定反应体系pH值。图2 不同初始pH值条件下pH值变化曲线Fig.2 pH changes with incubation time in different initial pH values表3 不同初始pH值条件下对滤纸分解Table 3 Decrease of filter paper in different initial pH value初始pH值Initial pH value崩溃时间Crashed time（h）分解量Decomposition value（g）分解率Degradation ratio（%）51080.420.006 a84.591.15 a6720.470.007 c93.921.36 c748
