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1、附录 J抗狂犬病血清效价测定法第一法 小鼠中和试验法（仲裁法）本法系根据抗狂犬病血清能中和狂犬病病毒的作用，将供试品与标准品做系列稀释，分别与狂犬病病毒悬液结合，小鼠脑内注射，在规定时间内观察小鼠存活和死亡情况，以测定供试品效价。试剂（1）量取0.9%磷酸二氢钾溶液75ml、2.4%磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）溶液425ml、8.5%氯化钠溶液500ml，混合后加水至5000ml，调pH值至7.28.0。于磷酸盐缓冲液98ml中，加入2ml灭能小牛血清，临用前配制。（2）20小牛血清磷酸盐缓冲液 称取磷酸二氢钾1.2g、磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)20.8g，加注射用水溶解
2、并稀释至1000ml，溶解后过滤，调pH至7.6。灭菌后pH值应为7.28.0。于磷酸盐缓冲液80ml中，加入20ml灭能小牛血清，临用前配制。 中和用病毒悬液的制备 （1）病毒悬液的制备 取CVS毒种(一般为冻干毒种)制成10-2悬液，制法见本法（2）项，脑内接种体重1012g小鼠每只0.03ml，待发病后取鼠脑再制成10-2悬液，接种于小鼠脑内进行传代，一般传23代。选用第5天发病并麻痹的鼠脑以脱脂牛乳研磨稀释成20%的脑悬液，按0.5ml分装安瓿,冻干后真空封口，制成冻干中和用病毒，-30冻存待用；或用第5天发病并麻痹的鼠脑用20%小牛血清磷酸盐缓冲液研磨稀释成10-1悬液，以每分钟20
3、00转离心20分钟，取上清液混匀后分装小管，-70冻存待用。（2）病毒悬液毒力的预测 冻干病毒的预测。取含20%脑悬液的冻干病毒，启开后加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液 1.0ml，吹打均匀后加入4.0ml 2%小牛血清磷酸盐缓冲液与病毒液充分混匀，以每分钟1500转离心10分钟，取上清液与等量的2%小牛血清磷酸盐缓冲液混合即为10-2悬液，然后再稀释至10-3、10-4、10-5、10-6，从10-6至10-2 的稀释液中各取0.5ml置于5个小管内，每管再加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液 0.5ml，置37水浴1小时。用体重1012g小鼠30只，分成5组，每组6只，用经37作用的10-6至10-2
4、病毒悬液接种小鼠，每个稀释度接种6只小鼠，每只小鼠脑内接种0.03ml，每天观察小鼠发病死亡情况，观察14天，接种后4天内死亡的小鼠按非特异性死亡计。以接种5天后的发病死亡小鼠统计LD50。 -70冻存病毒的预测。取含10%脑悬液的冰冻病毒融化后即为10-1悬液，然后再稀释至10-210-7。从10-7至10-3各取0.5ml加至5个小管内，每管再加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液 0.5ml，置37水浴1小时。用体重1012g小鼠30只，分成5组，每组6只，用经37作用的10-7至10-3病毒悬液接种小鼠，每个稀释度接种小鼠6只，每只小鼠脑内接种0.03ml，每天观察小鼠发病死亡情况，观察14天。
5、接种后4天内死亡的小鼠按非特异性死亡计。以接种5天后的发病死亡小鼠统计LD50。（3）中和用病毒悬液的制备 按病毒悬液预测的100个LD50的病毒稀释度作为中和用病毒悬液稀释倍数，用于小鼠中和试验。要求中和用病毒悬液经37水浴作用1小时的病毒量在32320LD50之间。抗狂犬病血清标准品溶液的制备 由国家药品检定机构提供，或用经国家药品检定机构认可的各生产单位工作用标准品。配制方法按使用说明书进行。供试品溶液的制备 用2%小牛血清磷酸盐缓冲液将供试品进行2倍稀释，一般可采用1800、11600、1102400，但可根据供试品实际效价适当降低或提高最低稀释倍数，如采用上述8个稀释倍数，则按稀释液
6、2.7ml加入供试品0.3ml作为110供试品溶液，然后再用稀释液3.5ml加入混匀的110的供试品溶液0.5ml作为180供试品溶液，再按稀释液2.7ml加入180的供试品溶液0.3ml作为1800供试品溶液（1）。再按0.5ml加0.5ml做倍比稀释制备供试品溶液（2）（8），它们的稀释倍数依次为11600、13200、16400、112800、125600、151200和1102400。测定法 取8个稀释度的供试品溶液（1）（8）各0.5ml置8支小试管中，另取8个稀释度的抗血清标准品溶液各0.5ml置8支小试管中，共16支小试管，分别加入中和用病毒悬液0.5ml，放置37水浴1小时，供
7、注射小鼠用。另用相同体重的小鼠测定中和用病毒悬液的实际LD50。其方法可将中和用病毒悬液作为原倍再稀释100、10-1、10-2、10-3等共4个稀释度，以上4个稀释度各加入0.5ml于小管内，每管再加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液 0.5ml，同样放置37水浴1小时作为中和病毒对照。将已中和的供试品和标准品的不同稀释度的悬液以及病毒对照分别接种小鼠，供试品和标准品按从浓到稀的倍数接种小鼠，而病毒对照则按从稀到浓的倍数接种小鼠。小鼠体重1012g，每只小鼠脑内接种0.03ml。每稀释度注射6只小鼠。每天记录小鼠的发病死亡情况，共观察14天，接种后4天内死亡的小鼠作为非特异性死亡计。供试品效价(IU
8、/ml)= B1 _ DB2式中B1为供试品ED50的倒数；B2为抗血清标准品ED50的倒数；D为抗血清标准品的国际单位，IU/ml。第二法 快速荧光灶抑制试验 （新增）本法系根据抗狂犬病抗体能中和狂犬病病毒的作用，将供试品与标准品做系列稀释，分别与狂犬病病毒悬液结合，感染敏感细胞， 在规定的时间内用荧光抗体染色并观察荧光灶减少的情况，以测定供试品效价。试剂：（1）含5%和10%小牛血清的DMEM细胞培养基 并加入终浓度为100u/ml抗生素和0.03谷氨酰胺，临用前配制。 （2）80% 冷丙酮 取80ml丙酮，加到20ml PBS(pH7.6，0.1mol/L)中，混匀，加盖密封后4冰箱保存
9、。 （3）磷酸盐缓冲液 称取磷酸二氢钾0.24g、磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）1.44g、氯化钠8g，加蒸馏水溶解并稀释至1000ml，用氢氧化钠调pH至7.2，临用前配制。 （4）80%甘油 量取80ml甘油，加入20ml蒸馏水中，混匀，加盖后4冰箱保存。 （5）0.25% 胰蛋白酶- EDTA。 （6）FITC标记抗狂犬病毒核蛋白抗体：按说明书要求稀释到工作浓度。 中和用病毒的制备 （1）病毒悬液的制备：取CVS11毒种（一般为冻干毒种）作适当稀释，以0.1 MOI的感染量接种生长良好的BSR细胞，37 5% CO2培养1天后转入34继续培养，2天后收集培养上清，4条件下4000
10、RPM离心10分钟去除细胞碎片，取上清液加入10小牛血清，混匀后分装小管， -70以下冻存备用。（2）病毒液的预滴定： 取冻存的毒种一支，冷水速融后在24孔培养板上从1：5开始做5倍系列稀释（100l病毒样品加入400l含5%灭能小牛血清的DMEM培养液中每孔，充分混匀后，然后每个稀释度取100l转移至96孔培养板，每个稀释度平行做2份，每孔再加入5106/ml的BSR细胞悬液50l， 37 5% CO2孵箱中培养24小时。培养结束后弃上清，PBS洗一遍，再用80冷丙酮（每孔50l）-30固定10分钟，甩干，室温干燥后每孔加入50l工作浓度的FITC标记抗狂犬病毒核蛋白抗体染色，37孵育30分
11、钟后，PBS洗3遍，每孔加50l80甘油于荧光显微镜下观察；计数每孔中的荧光灶数，取每孔荧光灶数在30以下的孔，记录相邻2孔荧光灶数，取其平均值，计算如下：病毒滴度FFU/ml = （最高稀释倍数孔荧光灶平均值5 + 相邻孔稀释倍数较低的荧光灶平均值）/2稀释倍数较低孔病毒稀释倍数20（3）中和用病毒液的滴定 方法同（3）病毒液的预滴定。在荧光显微镜下计数每孔中的荧光灶比例，选用可致80%的细胞被病毒感染而的病毒稀释度为中和试验用病毒稀释度。 （4）中和用病毒的准备 取一支冻存的病毒，流水融化后，用5%灭能小牛血清的DMEM培养液将病毒稀释至能致按“（3）中和用病毒液的滴定”项要求可致80%细
12、胞被感染的病毒稀释度，置冰浴备用。 抗狂犬病血清标准品的制备 由国家药品检定机构提供，或用经国家药品检定机构认可的各生产单位工作用标准品。配制方法按使用说明书进行。 供试品的制备 供试品预先经56 30分钟灭能，用含5%灭能小牛血清的DMEM培养液将供试品作3倍系列稀释，即在96孔培养板中每孔预先加入100l培养液，取50l供试品加入其中，成为1：3稀释度，充分混合和后，吸取50l加入下一孔100l培养液中，成为1：9稀释度，如此系列稀释至第12孔。 RFFIT方法 取供试品及标准品各稀释度50l 于96孔培养板中，加入中和用病毒，50l/孔，同时设空白孔对照（只加100l DMEM于孔中），
13、以及中和用病毒对照孔（含5%灭能小牛血清的DMEM 50l，加入中和用病毒50l），混匀后置37中和1小时，每孔加入1106细胞/ml 的BSR细胞悬液50l，置37 5% CO2孵箱中培养24小时。待培养结束吸干培养液，每孔中加入100l/ PBS清洗并吸干后，每孔加入预冷至4的80丙酮50l ，-30固定10分钟，弃丙酮，待挥发干燥后加入工作浓度的荧光标记抗狂犬病病毒核蛋白抗体，50l /孔，37孵育30分钟，甩掉液体，用PBS洗板23次，甩干液体，每孔加入80甘油50l，荧光显微镜观察。计算公式如下：标准品ED50 = lg (1/ 标准品低于50%荧光灶比例的稀释度) （0.5 标准品
14、低于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比）/ (高于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比 低于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比) lg稀释倍数 供试品ED50 = lg (1/ 标准品低于50%荧光灶比例的稀释度) （0.5 供试品低于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比）/ (供试品高于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比 供试品低于50%荧光灶比例孔的荧光灶百分比) lg稀释倍数 供试品效价 = （标准品ED50 供试品ED50）的倒数标准品的效价 供试品效价单位为 IU/ml。附注 （1）中和用病毒滴度不得小于106 FFU/ml。（2）病毒稀释时，应尽可能在冰浴中进行。（3）病毒对照孔应有80%细胞被荧光着色，细胞对照孔应无荧光，试验方可成立。
