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1、生 化 制 药 技 术威海职业学院生物与化学工程系二0一一年二月目 录前言1项目一 L-胱氨酸的制备与鉴定2项目二 溶菌酶的制备4项目三 卵磷脂的制备及鉴定6项目四 甘露醇的制备及鉴定7项目五 芦丁的提取与鉴定9参考文献 119前 言生化制药技术是生化制药技术专业的专业核心课程之一，生化制药技术实验实训指导书是本课程的重要组成部分。根据该课程教学大纲的规定，学生在掌握一定生化药品制备技术理论知识的基础上，必须通过实验实训学习，掌握生化药品制备常用的提取、分离、精制、干燥等方法和实验操作技术，培养学生科学认真的工作态度和熟练的基本操作技能。本实验实训指导书的编写，主要参照生化制药技术、现代生物制
2、药工艺学、天然植物化学等参考资料所收载的部分内容，结合本专业实训基地现有的实验实训条件，从中选出较为典型的生化药品实例的制备方法，供学生实验学习使用。实验设计包括氨基酸、蛋白质、酶、脂及多糖类等，生化药品制备与鉴定基本操作技术，以培养学生进行生化药品的生产制造与鉴别的能力。为了完成本课程实验实训教学大纲的学习内容，要求学生实验实训课前，必须认真预习，明确实验目的，熟悉实验内容和方法，并结合课堂教学，理解实验的基本原理；实验中必须有严谨的科学态度和实事求是的工作作风；严格操作，正确使用仪器，认真观察实验现象，详细、真实地做好实验原始记录；实验报告要求书写正确规范；严格遵守实验室规章制度，注意安全
3、，保持室内卫生。本实验实训指导书由李顺康、高英霞、殷永新、肖凤华、元超老师编写完成，主要供生化制药技术实验实训的学生参考。由于编者按水平有限，加之时间仓促，如有不当之处，恳请读者批评指正。 编者项目一 L-胱氨酸的制备及鉴定一、实验目的要求1、熟悉用人发制备氨基酸类药物的原理。2、掌握水解法制备氨基酸的方法。二、实验重点和难点L-胱氨酸的制备与精制方法。三、实验原理蛋白质由一定数量的氨基酸经过特定的排列方式组合而成的。因此，在一定条件下将蛋白质水解可得到各种氨基酸的混合液，再经过进一步的提取、精制，即可得到所需的氨基酸。本实验是用已洗净并干燥的人发，先用酸水解，然后调节pH至胱氨酸等当点（5.
4、05左右）时，胱氨酸从水解液中沉淀出来，经精制得到其结晶。四、实验仪器、试剂与材料1、仪器：500ml短颈圆底烧瓶、冷凝管、电热套、玻璃漏斗、玻璃棒、抽滤瓶、布氏漏斗、恒温水浴锅、真空泵、表面皿、烧杯、滤纸。2、试液：（1）10mol/L盐酸溶液：取盐酸90ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。（2）6%盐酸溶液：取盐酸6ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。（3）10%氢氧化钠溶液：取氢氧化钠10g，加水溶解，放冷，加稀释至100ml，摇匀，即得。（4）25%氢氧化钠溶液：取氢氧化钠25g，加水溶解，放冷，加稀释至100ml，摇匀，即得。（5）10%氨水溶液：取氨10ml加水稀释至100ml
5、，摇匀，即得。（6）2%硫酸铜溶液：取硫酸铜2g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。（7）0.1%EDTA溶液：取乙二胺四乙酸二钠0.1g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。（8）75%乙醇溶液：取无水乙醇75ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。（9）0.5%茚三酮-丙酮溶液：取茚三酮0.5g，加丙酮溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。3、试剂与材料：胱氨酸对照品、粉末活性炭、苯酚、盐酸、氢氧化钠、氨、硫酸铜、乙二胺四乙酸二钠、无水乙醇、95%乙醇、茚三酮、丙酮、人发。五、实验操作1、人发的处理：取无染色的人发，用碱性或中性洗涤剂洗净，用清水洗至水呈中性，晾干并剪短备用。2、回流
6、装置安装：在回流冷凝管上端接一弯玻璃管，下连一小漏斗用水封住，漏斗刚好接触水面，但不能伸到水中以免倒吸，避免氯化氢气体自仪器中逸出到空气中。3、水解：称取人发50g，置圆底烧瓶中，加10mol/L盐酸溶液100ml，加沸石或玻璃珠3粒，加热回流67小时，回流过程保持缓缓沸腾。水解完全后应不呈双缩脲反应，可停止反应，否则应继续水解至反应完全。4、双缩脲检查：取水解液3ml，加入少量粉末活性炭，在80水浴中脱色数分钟，过滤；向滤液中加10%氢氧化钠溶液3ml使呈碱性，然后沿管壁加2%硫酸铜溶液45滴，观察有无紫红色出现，若出现，水解未完全需继续水解。5、胱氨酸粗品制备：将水解液趁热过滤除去残渣，滤
7、液呈深棕色。当滤液温度降至60左右时在不断搅拌下，逐滴加入25%氢氧化钠溶液调pH至4.85.0，即产生胱氨酸沉淀。然后，置冷处过夜使沉淀完全，次日将沉淀置布氏漏斗中抽滤，并于5060干燥，得到胱氨酸粗品。6、结晶：称取胱氨酸粗品放入100ml烧杯中，加粗品4倍量4%盐酸溶液，加热至80左右，在不断搅拌下加约相当于胱氨酸粗品量15%的粉末活性炭，搅拌50分钟趁热抽滤。将滤液置于恒温水浴中加热至60不断搅拌下慢慢加25%氢氧化钠溶液，调pH至4.85.0，即有白色结晶迅速析出，放置56h后（在更长时间酪氨酸也可能与胱氨酸一同结晶出来）抽滤，得胱氨酸粗品。7、再次脱色并脱铁：取胱氨酸粗品放入100
8、ml烧杯中，加8倍粗品量6%盐酸溶液、5%粗品量粉末活性炭与0.1%EDTA溶液2ml，在80恒温水浴中搅拌30分钟，趁热减压抽滤。8、重结晶精制：将滤液置于60恒温水浴中，逐滴加10%氨溶液，调pH值至4.0（必须一滴一滴加，并不停的搅拌）左右，白色的胱氨酸结晶逐渐析出，放置过夜，抽滤，用少量纯化水洗涤结晶，再用75%乙醇洗涤，抽干。将胱氨酸纯品置表面皿上，于5060干燥，称重，计算产率。9、纯度鉴定：称取胱氨酸样品与对照品适量，配成相同浓度的溶液，用纸色谱法检查，以苯酚：水（7：3）为展开剂，以0.5%茚三酮-丙酮溶液为显色剂。在色谱图上应为单一斑点，Rf值应符合规定。六、结果与讨论1、计
9、算胱氨酸收率，讨论影响收率的因素。2、根据纸色谱结果分析所制备的胱氨酸纯度。项目二 溶菌酶的制备一、实验目的要求1、熟悉鸡蛋清制备溶菌酶的原理。2、掌握树脂吸附法、透析法及盐析法用于制备酶类药物的基本操作方法。二、实验重点和难点从蛋清中制备溶菌酶的工艺和操作方法。三、实验原理溶菌酶（EC3.2.1.17），又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基及芳香族氨基酸（如色氨酸）的比例很高。pH在l.211.3范围内剧烈变化时，其结构几乎不变，遇热也很稳定。在pH47，10O处理lmin仍保持原酶活性；pH5.5，5O加热4h后，酶变得更活泼；热变性是可逆的
10、，变性的临界点是77。随溶剂的变化变性临界点也有变化，当变性剂在pH1以下时，变性临界点降低到43。变性剂能促进酶的热变性，但变性剂过量时则酶的热变性变为不可逆。在碱性环境中用高温处理时，酶活性降低。十二烷基磺酸钠等对酶有抑制作用；滤纸也能抑制酶活性；氧化剂能使酶纯化；在6mol/L的盐酸胍溶液中酶完全变性；而在lOmol/L尿素中酶则不变性；用乙二醇、丙烯乙二醇、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、二氧杂环乙烷等有机溶剂进行变性实验，在5O以下时除乙醇、二氧杂环乙烷外，其他变性剂的浓度要在50%以上时才能使溶菌酶变性；氢氰酸能部分恢复酶活力。四、实验仪器、试剂与材料1、仪器：磁力搅拌器、电热套、电炉、蒸
11、馏装置、压片机、真空抽滤装置、透析袋、电动搅拌器、真空干燥箱。2、试液：（1）0.15mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）：取磷酸二氢钾0.68g,加0.1mol/L氢氧化钠溶液15.2ml，用水稀释至100ml，即得。（2）10%硫酸铵溶液：取硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，即得。（3）lmol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠4g，加水溶解，放冷，加稀释至100ml，摇匀，即得。（4）3mol/L盐酸溶液：取盐酸27ml加水稀释至100ml，摇匀，即得。3、试剂与材料：乙醇、乙醚、无水硫酸钠、丙酮、磷酸、硫酸铵、氢氧化钠、氯化钠、淀粉、砂糖、滑石粉、鸡蛋、724树脂、漏斗、滤纸、6
12、080目筛子。五、操作步骤1、原料处理：新鲜蛋清250g，测pH为8左右，除去蛋清中的脐带、蛋壳碎片及其他杂质。2、吸附：温度降到5左右，在搅拌中加入处理好的724树脂50g（湿重）使树脂全部悬浮在蛋清中，在05搅拌吸附5h，再将蛋清在05静置过夜。3、去杂蛋白、洗脱、沉淀：渐渐倾出上清液，树脂用清水洗去吸附的蛋白质，反复洗4次，注意防止树脂流失，最后将树脂抽滤去水分。另取0.15mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）15Oml分3次加入树脂中搅拌l5min，每次搅拌后减压抽滤去水分，再取10%硫酸铵溶液200m1，分4次洗脱溶菌酶，每次搅拌半小时，过滤抽干，合并洗脱液，按总体积加入32%固体硫酸
13、铵（质量体积比）使含量达到40%，有白色沉淀析出。冷处放置过夜虹吸上清液，沉淀离心分离或抽滤，得粗制品。4、透析：将粗制品加纯化水50ml使溶解，装入透析袋中在05透析2436h，除去大部分硫酸铵，得透析液。5、盐析：向澄清透析液中慢慢滴加lmol/L氢氧化钠溶液，随加随搅拌至pH值为8.59，如有白色沉淀应立即离心除去。然后在搅拌下加入3mol/L盐酸溶液使pH为3.5，按体积比缓缓加入5%固体氯化钠，即有白色沉淀析出。在0.5放置48h离心或过滤溶菌酶沉淀。6、干燥：沉淀加入10倍量冷至O的无水丙酮，不断搅拌使颗粒松散。冷处静置数小时，用漏斗滤去丙酮，沉淀用真空干燥直至无水丙酮脱水，即得溶
14、菌酶。7、制剂：取干燥砂糖粉，加入总量5%的滑石粉，通过120目筛；加5%淀粉，在搅拌机内搅拌均匀，制成软材，12目筛制粒；55烘干，用14目筛整颗粒，水分以控制在2%4%左右为宜；再按计算量加入溶菌酶粉混合，加1%硬脂酸镁，过16目筛2次，压制成溶菌酶口含片，每片含2Omg。六、注意事项1、注意原料的卫生，防止细菌污染变质，pH89，不要掺入蛋黄和其他杂质，避免影响收率和树脂对酶的吸附能力，操作的全过程要在低温（010）下进行，防止蛋清发酸、变质和酶失活。2、树脂再生、转型要彻底，提高收率。转为钠型后再用0.l5mol/L磷酸缓冲液（pH6.5）平衡过夜，平衡液的pH要保持在6.5。用过的树脂可用饱和氢氧化钠及浓盐酸直接浸泡，再生和转型后，再用缓冲液平衡。3、溶菌酶的洗脱峰较宽，有拖尾现象，可用三氯乙酸检查洗脱液，如沉淀不明显应另行收集，用作下次洗脱用。4、透析液加碱去杂蛋白时，碱液应均匀加入，勿使局部浓度过高造成酶失活。七、结果与讨论1、称重，计算溶菌酶的收率。2、讨论影响溶菌酶收率的因素。3、分析提取溶菌酶所需要树脂的选择原则。项目三 卵磷脂的制备及鉴定一、实验目的要求1、熟悉鸡蛋黄制备卵磷脂的原理。2、掌握卵磷脂的制备与减压蒸馏的基本操作方法。二、实验重点和难点从蛋黄中制备卵
