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1、佛手种质资源遗传1器材和方法材料佛手的叶片，经广州中医药大学鉴定教研室张丹雁教授鉴定。样品来源见表1。仪器与试剂Beckman-15CSR冷冻高速离心机；PCR仪；UVPGDS7600型凝胶成像仪；ECANSpectraFLUORplus多功能酶标仪。大连宝生物DR001AMPCR扩增试剂盒；上海生工随机引物；上海生工进口分装琼脂糖；上海申能博彩3s柱离心式植物基因组DNA试剂盒；天为时代DNAMarker；其他试剂均为国产分析纯试剂。表1样品来源方法佛手总DNA的提取和检测采用上海申能博彩公司的3s柱离心式植物基因组DNA试剂盒提取。将提取到的DNA用纯水稀释10倍后，用酶标仪分别测定其在2
2、60，280nm处的吸收值，计算出OD260与OD280的比值及DNA浓度，并以%琼脂糖凝胶电泳观察提取结果的优劣。佛手RAPD反应体系和扩增程序在对佛手PCR扩增体系优化后，确定反应的总体积为25l，包括：MgCl22l，引物l，dNTPs2l，10buffer缓冲液3l，lTaq酶，60ngDNA样品。PCR扩增程序为：94预变性4min，94变性1min,35退火lmin,72延伸，40次循环，最后72延伸10min，20保存。引物筛选选取德庆、青衣童子两种地理位置差异较大的DNA样品做模板，用110个引物对其进行PCR扩增筛选。扩增与产物检测13个佛手DNA样品作为扩增模板，用筛选的引
3、物及条件进行RAPD反应，扩增产物经电泳、染色后在凝胶分子成像仪上检测并拍照记录。数据分析将电泳图谱上清晰且可重复出现的条带记为“1”，同一位置没有出现条带的记为“0”，从而生成由“1”和“0”组成RAPD表型数据矩阵。统计每条引物扩增出的总带数和多态性带数，计算多态性位点百分率p=100%。利用求出Nei-Li相似系数矩阵，用UPGMA法对其进行聚类分析。2结果引物筛选110个引物中有51条引物扩增出条带，每条引物扩增带数115条，平均6条，扩增的谱带分子量大小在3002200bp，16条引物扩增的多态性带相对较多，且条带清晰、重复性好。扩增产物的多态性分析以16个10mer引物对供试的13
4、份材料进行PCR扩增，统计结果见表2。16个引物共扩增出185条带，其中多态性带有168条，占%；平均每个引物可扩增出条带，平均每份材料可扩增出条带，扩增的谱带分子量大小在3002200bp；各个引物间扩增的位点数相差较大，不同引物的扩增带数变幅从615条不等，其中扩增带数最多的引物为S23，具15条扩增带，最少的为引物S6，仅具6条扩增带，说明不同引物与供试材料总基因组DNA部分区域的同源性具有较大的差异。部分引物的扩增结果见图1。表216个引物的扩增结果聚类分析13份供试材料的Nei遗传相似系数矩阵如表3所示，经聚类分析构建亲缘关系树状图。相似系数分布在之间，说明佛手种质的遗传多样性较为丰
5、富。供试材料在相似系数为处分为3个类群，第1类群包括Sn1，Sn2，Sn3和Sn4，第2类群包括Sn5，Sn6，Sn7和Sn8，第3类群包括Sn9，Sn10，Sn11，Sn12和Sn13。表313份佛手种质资源的相似系数矩阵图中对应的各个泳道的品种顺序相同，从左到右依次为Sn1Sn8，DNAMarker，Sn9Sn13，阴性对照图1引物S24，S31，S80，S220的RAPD扩增图谱3讨论本研究应用RAPD技术对佛手种间亲缘关系进行了阐明，来源不同的13份种质的遗传多样性高达%，表明佛手现有的种质遗传变异较大，从而构成了较为丰富的种质资源基因库，说明佛手遗传基础广，具有较大的育种潜力和较强的
6、进化能力，这与佛手栽培历史悠久和种植范围较广有关。图2基于RAPD分析产生的佛手种质资源聚类图供试材料在相似系数为处分为3个类群，这与按照产地的不同将佛手分为广佛手、浙佛手和川佛手的划分一致。第1类群和第3类群中各种质之间的亲缘较近，这与它们在植物学形态上差异不大的情况相吻合。第2类群中4个栽培品种虽然在植物学形态上差异较大，但由于生长环境相同，在相似系数处聚为一类，亲缘关系也较近，可能是遗传基因和环境相互作用的结果；其中，Sn8为Sn5的芽变选育品种，两者在形态上有较大的差异，但分子水平上证明其遗传关系较近；Sn6和Sn7两者在叶片、花、果等植物学形态上差异较大，但其相似系数为，表明其亲缘关系较近，形态上的差异并未在分子水平上反映。第3类群中，Sn9与Sn10代表佛手的两种不同果型，以前通常按果型将佛手分为两种农家品种，但笔者在实地调查中发现，目前开手与拳手果型的分化不明显，同一树上经常会出现两种果型，而且春果一般为开手型，夏果一般为拳手型，表明佛手在长期的自然演化中，果型已出现了混杂，果型的差异并不能说明其遗传距离的远近。佛手种质资源遗传
