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1、 评阅意见大麦是世界上种植面积和产量仅次于小麦、水稻和玉米的重要作物，不仅用做粮食和饲料，也是酿造啤酒的主要原料，因此大麦品种遗传改良、特别是近年来的分子改良研究一直倍受重视。该论文利用农杆菌介导大麦茎尖组织进行大麦外源基因遗传转化为大麦分子改良提供了新的技术和方法，论文在技术和方法上有创新，实验设计合理，技术路线新颖，写作规范，研究结果有一定的参考和应用价值，但论文内容过于简单，建议以研究简报形式发表。根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化研究黎冬华1,2 廖玉才1,3李和平1,2（1. 华中农业大学麦类作物分子生物技术实验室，武汉 430070；2. 华中农业大学生命科学技术学院，武汉 430070
2、；3. 华中农业大学植物科学技术学院，武汉 430070）经株摘 要： 为了建立农杆菌介导的大麦茎尖遗传转化技术，本研究以我国大麦主推品种鄂大麦9号、鄂大麦32122为材料，以农杆菌介导法转化大麦茎尖，经PPT筛选获得了转除草剂基因的大麦株系。PCR鉴定表明，以鄂大麦9号茎尖为受体，筛选获得4个转基因植株，阳性率为0.59%；以鄂大麦32122茎尖为受体，筛选获得了10个阳性植株，阳性率为1.96%。转基因T1代Southern杂交分析证实，外源基因确已整合到大麦基因组中，已鉴定的转基因株系均含单个转基因拷贝，不同转基因株系整合的位点不同。因此大麦茎尖可作为农杆菌转化的受体。这些研究结果为拓宽
3、大麦遗传转化受体提供了技术和方法。 关键词：大麦；茎尖；农杆菌介导的转化 Transformation of shoot apical meristems of elite barley cultivars via Agrobacterium-mediated transformationLI Donghua1,2, LIAO Yucai1,3, LI Heping1,2*（1. MolecularBiotechnology Laboratory of Triticeae Crops, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, PR Chi
4、na2. College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, PR China3. College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, PR China）Abstract：To develop a method for transformation of barley shoot apex through Agrobacterium-mediate
5、d strategy, two elite barley cultivars from China were used the transformation with their shoot apexes as explants. After selection on PPT media, transgenic lines resistant to herbicide were obtained. PCR identification showed that 基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20070504010）和转基因专项（2009ZX08002-001B）。作者简介：黎冬华（1
6、984），男，硕士，主要从事植物生物技术研究。email: 通讯作者：李和平（1953），女，教授，博士生导师，主要从事麦类作物分子生物学研究。email: four transgenic lines derived from the cultivar E-damai9, and ten transgenic lines from the cultivar E-damai32122 contained expected transgenes, with a transformation efficiency of 0.59% (E-damai9) and 1.96% (E-damai32122
7、), respectively. Southern blot analysis of T1 transgenic lines demonstrated that foreign genes were indeed integrated into the barley genome. From the analyzed transgenic lines, it is clear that all transgenic lines contained one copy per genome, and different lines displayed varied patterns of the
8、transgenic integration. Thus barley shoot apex can be used for genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens, and the current results provide useful information for exploitation of barley shoot apex as explants for genetic transformation. Key words：barley；shoot apex；Agrobacterium-mediated tra
9、nsformation大麦（Hordeum vulgare L.）是世界上种植面积和产量仅次于小麦、水稻和玉米的重要作物，不仅用做粮食和饲料，也是酿造啤酒的主要原料，因此大麦品种遗传改良研究一直倍受重视。随着生物技术的发展，自1994年基因枪成功转化大麦以来，大麦遗传转化研究也得到快速发展，不同外植体如幼胚、小孢子、原生质体、悬浮细胞等已用于大麦遗传转化，其中幼胚及其愈伤组织，是大麦转化研究中应用最多的外植体1-5。农杆菌介导的转化以其操作简单、转化成本低、拷贝数少等优点，已广泛用于多种植物的遗传转化及新品种培育。1997年，Tingay 等首次报道了农杆菌介导的大麦幼胚遗传转化3，但是获取幼
10、胚或小孢子所需的时间长，受大麦生长季节限制，易受外界环境及受体基因型的影响，因而以幼胚为外植体的转化技术，其发展及应用受到限制。利用植物茎尖为转化受体，不必经过诱导愈伤及分化成苗阶段，转化后可以直接成苗，转化及成苗周期短。茎尖已成功用于一些双子叶植物遗传转化，包括大豆、棉花、花生、向日葵、葡萄和豌豆 6-11，以及部分单子叶植物的转化12。在大麦中，Zhang 等研究了基因枪介导的大麦茎尖转化13，而农杆菌介导的茎尖转化仍未见报道。本研究的目的是，建立农杆菌介导的大麦茎尖转化技术体系，筛选适宜转化的我国主推大麦品种和培养条件，为利用基因工程来改良大麦品种提供方法技术。1 材料与方法1.1 大麦
11、品种 大麦品种鄂大麦9号、鄂大麦32122由湖北省农业科学院作物研究所李梅芳研究员惠赠。根癌农杆菌（Agrobacterium tumefacience）菌株GV3101、质粒pMBL-BAR-UTGFP来自本实验室。1.2 培养基萌发培养基：MS培养基14，加1 g/L 水解酪蛋白，0.69 g/L L-脯氨酸，30 g/L蔗糖和6 g/L琼脂粉，pH 5.8；其它培养基参照文献2,3。1.3 农杆菌菌液的准备将含转化质粒的农杆菌GV3101菌液按1：50的比例接种到YEB液体培养基，28 ，200 r/min振荡过夜培养。待培养至菌液的OD600=0.60.8时，离心（4500 r/min
12、，10 min）收集菌体，以浸染培养基重悬菌体至OD600=0.60.8时，浸染大麦茎尖。 1.4 大麦茎尖选取健康饱满的大麦颖果，去除稃片，用70 %乙醇浸泡3 min，然后用0.1 % HgCl2 浸泡1315 min，无菌水冲洗4次每次2 min，消毒的种子浸泡在无菌水中、室温萌动16 h，剥取成熟胚，盾片向下放置在MS培养基上14，每皿放置30个成熟胚，待萌发后用于转化。1.5 转基因大麦的PCR 检测和 Southern杂交检测1.5.1 转基因大麦的PCR检测。997al. 9 tion and 用CTAB法提取T0代转基因大麦株系和未转化野生型大麦株系的叶片基因组DNA，Ubi（
13、ubiquitin）启动子序列PCR扩增引物由上海博亚生物工程公司合成。Ubi-P5 primer：5-CATCTCTGTATATGCATCAG-3,Ubi-P6 primer：5-CGGTAGTTCTACTTCTGTTC-3。这一对引物可以扩增一个约500 bp 的特异DNA片段。PCR反应程序为：95 预变性4 min；94 变性1 min，58 退火1 min，72 延伸1 min，36 个循环；72 延伸10 min。琼脂糖凝胶检测PCR产物。1.5.2 转基因植株的Southern 杂交 对PCR鉴定为阳性的转化植株和对照植株，取30 g大麦基因组DNA，用 SacI 酶切DNA，以
14、Ubi-P5/P6序列为探针模板，用放射性同位素-32P-dCTP标记的Ubiquitin启动子为杂交探针，按照文献3方法进行Southern 杂交。2 结果与分析2.1农杆菌介导的大麦茎尖转化 取鄂大麦9号成熟胚在22 萌发生长4 d的幼苗（图1，A），除去根、盾片及幼叶，留下5 mm左右的茎尖，用针刺伤生长点，置于高渗培养基上处理2 h（图1，B），加入农杆菌菌液浸染茎尖25 min，超声波处理15 s。取出经农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液，于22 共培养2 d，转至恢复培养基、25 培养7 d（图1，C），再转到生根筛选培养基上筛选3轮，每轮10 d。筛选获得的阳性苗春化处理
15、2周后，移栽到土钵中，于生长室中培养（图1，D）。ABCD图鄂大麦9号茎尖转化及转基因植株培养Fig. 1 Transformation of E-Damai 9 shoot apex and growth of transgenic barley plants2.2 转基因植株的PCR鉴定按照上述方法，剥取大麦品种鄂大麦9号的茎尖670个，经农杆菌浸染转化、筛选，经PCR鉴定，获得PCR阳性植株4株，阳性率为0.59%。取鄂大麦32122茎尖510个，转化后经PCR鉴定，筛选获得PCR阳性植株10株，阳性率为1.96%。这些转基因植株均含有预期的约500 bp的DNA片段，图2展示了鄂大麦32122转基因植株的PCR鉴定结果（阳性材料编号，1至8及10；11未转化对照，12为不含D
