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1、FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交）实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。掌握原位杂 交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。2. 实验原理荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技 术，是20 世纪80 年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂 交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒 感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。FISH的基本原理是用已 知的标记单链核酸为探针，
2、按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合， 形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而 可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位 杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分 子细胞遗传学领域受到普遍关注。杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星 III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易 于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极
3、端不 同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置 探针，由一个或几个克隆序列组成。探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标 记是采用生物系标记的dUTP（biotin-dUTP）经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素 的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白荧光素、生物素化的抗抗生 物素蛋白、抗生物素蛋白荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测 500bp 的片段。 而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针 时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于
4、不能进行信号放大，因此灵 敏度不如间接标记的方法。实验用具及材料 3.Y 染色体探针、人外周血中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、 Nikon E-400、荧光显微镜、盖玻片、封口膜、200mL移液器、20mL移液器、暗盒、指甲油、甲 酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、吐温 20。4. 实验方法及步骤1）探针及标本的变性（1 ）探针变性将探针在75C怛温水浴中温育5min，立即置0C, 510min,使双链DNA探针变性。（2）标本变性 将制备好的染色体玻片标本于50C培养箱中烤片23h。（经Giemsa染色的标本需预先在固 定液中退色后再烤片）。 取出玻片标本，将其浸在7
5、075C的体积分数70%甲酰胺/2XSSC的变性液中变性23min。 立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次 5min，然后空气干燥。2）杂交将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18X18 盖玻片，用Parafilm封片，置于源潮湿暗盒中37C要交过夜（约1517h）。由于杂交液较少， 而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。3）洗脱此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。（1）杂交次日，将标本从37C温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。（2）将已杂交的玻片标本放
6、置于已预热4250C的体积分数50%甲酰胺/2XSSC中洗涤3 5min 次，每次（3）在已预热4250C的1XSSC中洗涤3次，每次5min。（4）在室温下，将玻片标本2XSSC中轻洗一下。4）杂交信号的放大（1）在玻片的杂交部位加150mL封闭液I,用保鲜膜覆盖，37C温育20min。（2）去掉保鲜膜，再加150mL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37C继续温育40min。（3）取出标本，将其放入已预热4250C的洗脱液中洗涤3次，每次5min。（4）在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II,覆盖保鲜膜，37C温育20min。（5）去掉保鲜膜，加150mL antiavi
7、din于标本上，覆盖新的保鲜膜，37C温育40min。（6）取出标本，将其放入已预热4250C的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。（7）重复步骤（1）、（2）、（3），再于2XSSC中室温清洗一下。（8）取出玻片，自然干燥。（9）取 200mL PI/antifade 染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。5）封片可采用不同类型的封片液。如果封片中不含有Mowiol （可使封片液产生自封闭作用）， 为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20 -70 C的冰箱中的暗盒中保持数月之久。6）荧光显微镜观察 FISH 结果先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野
8、，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波 长为490nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针的探针所在位置发出绿色荧光。由于 本实验使用的是Y染色体上的特异序列，因此在男性外周血染色体标本的杂交中呈阳。）16-1 （图照相记录实验结果也可以观察到明显的杂交信号。即使在末分裂的细胞中，性，附录 I FISH 相关溶液的配制1）20XSSC： 175.3g NaCl, 882.g 柠檬酸钠，加水至 1000mL （用 10mol/L NaOH 调 pH 至 7.0）。2）去离子甲酰胺（DF）:将10g混合床离子交换树脂加入100mL甲酰胺中。电磁搅拌30min, 用 Whatmanl 号滤
9、纸过滤。3）体积分数70%甲酰胺/2XSSC： 35mL甲酰胺，5mL 20XSSC，10mL水。4）体积分数 50%甲酰胺/2XSSC： 100mL 甲酰胺，20mL 20XSSC，80mL 水。5）体积分数50%硫酸葡聚糖（DS）： 65C水浴中融化，4C或-20C保存。6）杂交液：8mL体积分数25%DS, 20mL 20XSSC混合。（或40mL体积分数50%DS, 20mL 20XSSC，40mL ddH2O混合）取上述混合液50mL，与5mL DF混合即成。其终浓度为体积分 数 10% DS 2XSSC，体积分数 50% DF。7）PI/antifade 溶液PI原液：先以双蒸水配
10、置溶液，浓度为100mg/mL，取出1mL,加39mL双蒸水，使终 浓度为 2.5mg /mL。Antifade原液：以PBS缓冲液配制该溶液，使其浓度为10mg/mL，用0.5mmol/L的 NaHCO3调pH值为&0。取上述溶液1mL，加9mL甘油，混匀。Pl/antifade溶液：PI与antifade原液按体积比1: 9比例充分混匀，-20C保存备用。8）DAPI/antifade 溶液：用去离子水配制 1mL/mg DAPI 储存液，按体积比 1:300,以 antifade 溶液 稀释成工作液。9）封闭液 I：体积分数 5% BSA 3mL, 20XSSC ImL, dd H2O
11、ImL, Tween 20 5mL 混合。10）封闭液 II：体积分数 5% BSA 3mL, 20XSSC 1mL, goat serum 250mL, dd H2O 750mL, 混合。 Tween 20 5mL11）荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL, 20XSSC 1mL, dd H2O 3mL, Tween 20 5mL 混合。12）洗脱液：100mL 20XSSC,加水于 500mL，加 Tween20 500 mL。13）TE 缓冲液：pH8.0: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA；pH7.6: 10mmol/L Tris, HCl,
12、 1mmol/L EDTA；pH7.4: 10mmol/L Tris, HCl, 1mmol/L EDTA。14）溶液 I： 25mmol/L Tris HCl（pH 7.4）, 10mmol/L EDTA。15）溶液 II： 10% SDS, 0.2M NaOH。16）溶液 III： Kac 14.7g, HAc 5.8mL,加水至 50mL。17）LB培养基：胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g, NaCl 10g,加水至1000mL,用5mmol/L NaOH 调 pH 值至 7.0。附录 II DNA 探针的制备质粒 DNA 克隆的提取、纯化和鉴定。1）用接种环挑取一小块-70C冻存的转化
13、菌，接种于5mL LB培养基中，37C剧烈震荡过夜。2）将收集到的菌液3000r/mm离心10mm，弃掉上清液。3）向菌体沉淀中加入溶液I300mL，溶液II 350mL，混匀后将其置于冰浴中片刻，再加溶液III 350mL混匀，加酚和氯仿混合液（体积比为1： 1） 500mL后充分混匀。4）12000r/min 离心 10min。5）取上清液，向其加入600mL异丙醇，充分混匀后以12000r/min离心1530min,弃掉上清液。 次，晾干。32乙醇洗涤沉淀70%体积分数1500mL）用6.7）用TE缓冲液溶解DNA沉淀。8）加水至200mL，以Rnase A （终浓度200mg /mL）
14、 在 50C水浴中消化30min。9）加入酚、氯仿和异丙醇（三者体积比25： 24： 1）溶液200mL混匀，12000r/min离心2min。10）取上清液，再加入氯仿和异戊醇溶液（体积比为24： 1） 200mL混匀，12000r/min离心2min。11）取上清液，以20mL 3M NaAc及500mL体积分数100%乙醇沉淀DNA。12）可将上述溶液在-70C放置30min至1h以充分沉淀DNA,然后用12000r/min离心15min。13）将沉淀用1.5mL体积分数70%乙醇轻洗，自然晾干。14）用TE缓冲液溶解DNA。15）取12mL上述纯化的DNA溶液，于8.0g/L琼脂糖/T
15、BE缓冲液凝胶电泳鉴定DNA并检测 浓度。16）取1mg DNA,用相应限制性内切酶45单位，BSA100200mg /mL，于37C水浴中酶解 24h。17）电泳观察，根据酶切片段数量及大小，估计DNA克隆插入片段大小。 附录 III 探针的生物素标记探针的标记可采用PCR或缺口平移法来制备，但多数情况下采用缺口平移法来制备。 该过程包括以 DNase I 在 DNA 双链上作用产生缺口并以此作为第二反应步骤的作用赳噗，即大 肠杆菌聚合酶 I 自缺口处进行修补合成。在修补合成互补链时将生物素标记的 d-NTP 掺入，从 而复制出带有生物素标记的探针。本实验采用缺口平移法，按GIBCO公司提供的方法以 biotm-14-dATP标记探针。标记好的探针可以在-20C下长期保存。 总反映体积 50mL, DNA lmg,10XdNTP 5mL, 10XEnzyme Mix 5mL。 其中 10XdNTP 为：500mmol/L Tris HCl(pH 7.8) 50mmol/L MgCl2硫基乙醇100mmol/LB-去除核酸酶的牛血清白蛋白100mg /ml0.2mmol/L dCTP, 0.2mmol/L dGTP, 0.2mmol/L dTTP0.1mmol/L dATP, 0.1mmol
