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1、实验八 色素的分离(层析法)一、目的要求1掌握薄层板的制备及薄层层析的操作方法。2掌握吸附剂活度测定的原理及方法。3. 掌握偶氮苯和苏丹红（III）的分离方法二、实验原理薄层层析是将吸附剂或者支持剂（有时加入固化剂）均匀地铺在一块玻璃上，形成薄层。把欲分离的样品点在薄层板的一端，然后将点样端浸入适宜的展开剂中, 在密闭的层析缸中展开，使混合物得以分离的方法。由于层析在薄层上进行故而得名。薄层层析是一种微量、快速的层析方法。它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定，还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。薄层层析根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸
2、附剂)、薄层分配层析(纤维素、硅胶、硅藻土)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。薄层层析中以吸附薄层为多用，吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶（氧化铝的活化温度为150160，硅胶的活化温度为105110）。吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同，及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分离。分配薄层层析在展开过程中，各成分在固定相和流动相之间作连续不断的分配，由于各成分在两相间的分配系数不同，因而可以达到相互分离的目的。薄层层析选择展开剂视被分离物的极性及支持剂的性质而定。如果薄层层析所用的支持剂是吸附剂，在同一吸附剂上，不同化合物的吸附性质有
3、如下规律：1.饱和碳氢化合物不易被吸附；2.不饱和碳氢化合物易被吸附，分子中双键愈多，则吸附得愈紧密；3.当碳氢化合物被一个功能基取代后，吸附性增大。吸附性较大的化合物，一般需用极性较大的溶剂才能推动它。选择展开剂的另一个依据是溶剂的极性大小。极性大的化合物需用极性大的展开剂，极性小的化合物需用极性小的展开剂。一般情况下，先选用单一展开剂如苯、氯仿、乙醇等，如发现样品个组分的Rf值较大，可改用或加入适量极性小的展开剂如石油醚等。反之，若样品的个Rf值较小，则可加入适量极性较大的展开剂展开，或在原来的溶剂中加入一定量极性较大的溶剂进行展层。在实际工作中，常用二种或三种溶剂的混合物作展开剂，这样更
4、有利于调配展开剂的极性，改善分离效果。通常希望Rf值在0.2-0.8范围内，最理想的Rf值是0.4-0.5之间。溶剂极性大小的次序是：石油醚 二硫化碳 四氯化碳 三氯乙烯 苯 二氯甲烷 氯仿 乙醚 乙酸乙酯 乙酸甲酯 丙酮 正丙醇 甲醇 水。三、时间安排 步 骤所需时间/h薄层板的制备1.0硅胶的活度测定1.0薄层板的应用2.0合计4.0四、实验材料、试剂与仪器1. 仪器与设备载玻片、玻璃片、毛细管、层析缸、滴瓶、喷雾瓶、电吹风、喷雾器、烘箱、干燥器、直尺。2. 药品硅胶G、羧甲基纤维素钠、展开剂、显色剂等。五、实验方法与步骤1.薄层板的制备（1）硅胶（G）薄层板的制备【调浆】 取硅胶G或硅胶
5、GF（吸附剂）1份约3g，置烧杯中，慢慢加入含0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液8ml，调成均匀的膏状.【涂布】 用滴管吸取此糊状，涂布洁净、干燥的玻璃板上（轻轻振动玻璃板，使薄层面平整均匀，表面光洁）【干燥】 室温下在水平位置放置0.5h，待薄层发白近干。【活化】 将凉干的薄层板置于烘箱中105活化0.5-1 h，冷后贮于干燥器内备用。活化温度和时间可依需要调整，一般检识水溶性成分或一些极性大的成分时，所用薄层板只在空气中自然干燥，不经活化即可贮存备用。青岛海洋化工厂出售的薄层层析用硅胶在吸附剂名称之后加几个字标明的意思是：硅胶G（G是Gypsum石膏的缩写，表示加了石膏）、硅胶H（H表示不加石
6、膏）、硅胶GF254（F254表示加石膏和波长254显绿色荧光的硅酸锌锰）、硅胶GF365（表示加石膏和波长365nm显黄色荧光的硫化锌镉）铺板的加水量及活化时间薄层板类型吸附剂：水的量活化温度（）活化时间（h）活度氧化铝G氧化铝-淀粉硅胶G硅胶-CMC-Na硅胶-淀粉硅藻土1：21：21：2或1：31：2（0.7%CMC-Na液）1：21：2250150105110110105440.50.50.50.5-2. 吸附剂硅胶的活度测定一般选用三种染料的薄层层析法进行测定。欧洲药典1969年记载用0.01 %二甲基黄（Dimethy-yellow. p-Dimethylaminoazobenze
7、ne）、苏丹红（Sudan ）、靛酚蓝（Indophenol blue 4-Tapnthoquinone-4-dimethyl aminoaniline）的苯溶液各10 l点滴于硅胶G或硅胶H薄层上，以苯为展开剂，展开10 cm（约20 min），三种染料应明显分离，靛酚蓝斑点接近于起始线，二甲基黄斑点在薄层的当中，苏丹红斑点在靛酚蓝与二甲基黄斑点之间，则认为薄层板活性符合要求。1.点样取上述方法制备好的薄层板，在距一端1cm处，用铅笔轻轻划一条线作为起始线，将样品溶液用管口平整的毛细管点于起始线上。点样的要求：点样量适当，样点直径小于2-3 mm；干后间隔反复点样；多个样点时，间隔为2 cm
8、且处于同一条直线上。分别点上苏丹红，偶氮苯以及混合物【展开】 在层析缸中加入扩展剂1cm厚，加盖平衡0.5 h。当样点上的溶剂充分挥干后，将薄层板点样端浸入扩展剂，扩展剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干。要求：密闭容器可选用层析缸、标本缸、标本筒等；展开方式有上行法、下行法之分，展开方向有单向、双向、多次展开等。【显色】 如果化合物本身有颜色，就可直接观察它的斑点。如果本身无色，可先在紫外灯光下观察有无荧光斑点（有苯环的物质都有），用铅笔在薄层板上划出斑点的位置；对于在紫外灯光下不显色的，可放在含少
9、量碘蒸气的容器中显色或者用适当的显色剂处理来检查色点（因为许多化合物都能和碘成黄棕色斑点），显色后，立即用铅笔标出斑点的位置，以方便计算各个斑点的比移值，从而提供定性与定量的依据。【比移值的计算与定性、定量】 展开结束后，经过各种显色操作后，样品中各个成分的斑点可能出现了不同程度的分离，为了表达各成分的相对位置（极性）通常以比移值作为称量斑点位置的指标。比移值的符号为Rf：注意事项：薄层层析的Rf值受多种因素影响，即使严格按照实验要求做了，结果的重现性仍较差。因此，薄层定性时常与标准品一起点样进行对比分析。六、思考题3. 薄层板的涂布要求是什么？为什么要这样做？4. 点样的要求是什么？为什么要这样做？5. 展开前层析缸内空间为什么要用溶剂蒸汽预先进行饱和？6. 在一定的操作条件下为什么可利用Rf值来鉴定化合物？7. 在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位置？8. 展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色谱有何影响？
