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1、实验六 水稻基因组DNA的 Southern杂交 与非放射性ECL直接核酸标记及检测【实验目的】通过本实验学习和掌握Southern转膜、辣根过氧化物酶直接标记探针、Southern杂交及增强化学发光（ECL）检测分子杂交结果的过程。【实验原理】Southern杂交是一项在复杂的背景基因中识别特异性DNA序列的重要技术之一，它是Southern于1975年首创的杂交方法。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链DNA在一定的条件下可按碱基互补原则（A=T,C=G）形成双链。杂交的双方是待测核酸序列及标记的探针。此杂交过程是高度特异性的。ECL直接核酸标记及检测系统用辣根过氧化物酶（HRP）直接
2、标记探针。该法用带正电荷的核酸标记试剂（经修饰成为带正电荷的HRP聚合体：HRP对苯醌聚乙烯亚胺复合物）与变性过的、带负电荷的单链核酸探针松散连接，然后加入戊二醛，在戊二醛的化学交联作用下与带负电荷的单链DNA共价结合，从而标记DNA。标记的探针DNA与膜上的单链DNA杂交形成双链DNA，探针上的HRP在H2O2存在下，催化H2O2还原，同时使鲁米诺氧化并伴随蓝光产生，在增强剂的作用下使产生的光加强，从而可在X光片上检测。首先将经限制性内切酶酶解的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳分离以及在凝胶上经NaOH处理使之变性，然后将尼龙膜（Hybond-N+）放在凝胶上，使之按原有顺序将条带转移至膜上并固
3、定起来，这是Southern转膜过程。 Southern膜杂交是将吸附并固定在Hybond-N+尼龙膜上的DNA片段与一个标记的探针杂交，最后经过显影从光片上显现出杂交分子的区带。 本实验中，经琼脂糖凝胶电泳分离的水稻基因组DNA酶切产物，通过Southern转移，将其吸印在Hybond-N+尼龙膜上，通过辣根过氧化物酶直接标记探针，与膜上的水稻DNA进行杂交，再用增强的化学发光方法得到分子杂交结果。本实验所用的探针来源于水稻和大麦，具有抗病基因NBS-LRR结构特点的DNA探针，因此水稻DNA和探针之间有较好的同源性，可得到杂交带，可满足初学者对Southern杂交方法进行训练。【仪器、材料
4、与试剂】（一） 仪器恒温水浴器 烤箱 台式高速离心机 琼脂糖凝胶电泳系统 高压灭菌锅 -70或-20冰箱（二）材料限制性内切酶 ECL试剂盒 氯化钠（NaCl） 柠檬酸钠 盐酸（HCl） 氢氧化钠（NaOH） 蔗糖 硼酸 溴酚蓝 十二烷基硫酸钠（SDS） 显影粉 定影粉 溴化乙锭（EB） 20l, 100l, 1000l微量加样器及吸头，小指管Whatman No.1滤纸及普通滤纸 10 cm5 cm玻璃板 尼龙膜（Hybond-N+）卫生纸（或吸水纸） 裁纸刀 杂交盒 500重物 光片夹及光片 剪子、镊子、刀片、胶带 保鲜膜 一次性手套（三）试剂1 20SSC（1000 mL）：3 mol/
5、NaCl（175.32g）；0.3 mol/柠檬酸钠（88.26），用1 mol/HCl调至pH7.02 变性溶液（500mL）：1.5 mol/NaCl（43.83）；0.5 mol/NaOH（10）3 中和溶液（500mL）：1.5 mol/L NaCl（43.83）；0.25 mol/L NaOH（5）4 TBE（250 ml）：13.5g Tris，6.9 g硼酸，0.9g EDTA-Na2，用蒸馏水定容至250 ml5 TE（10mL）：10 mmol/Tris-HCl；1 mmol/EDTA pH8.06 0.25 mol/HCl（500 mL）7 6溴酚蓝载样液（1mL）：0.2
6、5溴酚蓝；40蔗糖8 EB染色液：0.5 l/ 溴化乙锭【实验步骤】（一）基因组DNA的提取（略）（二）样品的限制性酶切及酶切效果检查1 在1.5 ml 离心管中加入5 mg 基因组DNA进行限制性酶切；加入1/10终体积的10反应缓冲液和50U限制酶（如Dra I）。加ddH2O至酶切反应终体积。将反应物按照厂商说明在适当温度温育(如37下反应过夜)。2 取10%或更少体积已酶解的温育混合物，用0.5TBE缓冲液于0.8%琼脂糖胶上进行电泳，片段分开及染色后，可见DNA弥散带。部分酶解的样品DNA在胶的顶端可见一条未酶解的带，已酶解的DNA弥散带亮度较弱。根据不同道上弥散带亮度，调节DNA量
7、以确保有等量的DNA进行电泳。（三）Southern转移（以下操作要戴上一次性手套）1 将酶解的DNA样品小心加入0.8%琼脂糖胶的加样孔中。各取20ng 1Kb plus和Control DNA (HindIII酶切的DNA)梯度标准参照物，分别与6加样缓冲液混匀后加入第一与最后一个加样孔中。以25V电泳2448 h。2 将琼脂糖胶浸入0.25 mol/L HCl溶液中10 min（至溴酚兰由蓝色变桔黄色），使DNA脱嘌呤。3 将胶浸入变性液（0.5 mol/L NaOH、1.5 mol/L NaCl）中变性30 min，使DNA双链变性成单链。4 将胶浸入中和液（0.25 mol/L Na
8、OH、1.5 mol/L NaCl）中平衡20 min。5 准备一个供DNA从胶上向尼龙膜转移的玻璃平台。将一张0.2um的Hybond-N+尼龙膜（英国Amersham公司生产）和一张滤纸切成与待转移胶相同大小，另将一张滤纸切成与胶相同宽度，长度较长足以达到盛转移液盒子的底部。6 将较长的滤纸在转移液（0.25 mol/L NaOH、1.5 mol/L NaCl）中浸湿后置于平台上，两端浸入转移液中（使溶液不断地吸到滤纸上）。将胶置于滤纸上部，用玻璃棒仔细赶掉凝胶与滤纸间的气泡，用镊子将Hybond膜置于胶上并用玻璃棒赶掉Hybond膜与凝胶间的气泡，将剩下的滤纸在转移液中浸湿后置于膜上，再
9、次赶尽气泡。放一叠卫生纸（与尼龙膜同样大小，约1000g）压在滤纸上部，再放相同尺寸的玻璃板，最后放一重物（约500g）在玻板上，让凝胶上的DNA转移12或过夜。7 将尼龙膜与凝胶剥离，凝胶用EB染色后观察（胶上应无桔黄色荧光条带，说明DNA转移完全）。弃去胶，把尼龙膜浸在6SSC溶液中，约5min后取出。8 将尼龙膜夹在4层普通滤纸中，置80烘箱中烤2 h，使已转移的DNA与膜交联。（四）探针标记DNA探针采用具有抗病基因NBS-LRR结构特点的探针（可通过PCR扩增制备），用ECL系统（英国Amersham公司生产）进行标记。取所需标记的DNA探针于95变性5 min，冰浴5 min；然后
10、加入与探针等体积的DNA标记试剂（带正电荷的辣根过氧化物酶聚合体）和化学交联剂戊二醛溶液；混匀并短暂离心后37保温10 min，放于冰上备用。（五）Southern杂交1 将已烘烤过的膜放入杂交盒中，加入预热的含有0.5mol/L NaCl和5%封闭试剂的杂交液（英国Amersham公司生产），使杂交液刚好没过尼龙膜，置于42预杂交1h（预杂交的目的是防止标记的探针与尼龙膜非特异性结合，从而使背景更清晰）。2 加入已标记的探针，混匀后于42杂交过夜（变性探针与膜上的特异性序列杂交）。3 弃杂交液，以55初洗液（0.4% SDS, 0.5SSC）漂洗两次，每次10min，弃初洗液后，用2SSC再漂洗两次，各5 min（洗膜目的是将尼龙膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针分子从膜上洗去）。4 尼龙膜稍作吸印或晾干过多的漂洗液后，加等量的观察液1（H2O2）和观察液2（鲁米诺及增强剂）处理膜1分钟。5 移去过多的观察液，用保鲜膜包好尼龙膜，置于X光片夹中。6 在尼龙膜上压上X光片曝光1-2小时（在暗室中进行）。7 冲洗X光片（显影一水洗一定影），分析杂交条带。所得数据用统计软件进行聚类分析。2
