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1、细胞免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋 白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧 光。实验步骤如下：1. 已转染72h的细胞种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS洗三遍，每次5分钟。2. 细胞半干时，覆盖以4% 冷的多聚甲醛固定15 分钟，避光。3. 吸去多聚甲醛后，用冰PBS洗三遍，每次5分钟。4. 0.5%Triton X-10覆盖细胞10分钟，冰PBS洗三遍，每次5分钟。5. 与二抗相同宿主的血清？进口胎牛血清室温封闭30 分钟。6. 配制一抗(SAB2104246-50UG, Sigma,
2、USA): SAB+FBS=1：200。7. 加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4度避光过夜。次日：8. 取出细胞复温至室温约1 h 。9. 冰1%oTween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。10. 配制荧光标记二抗：Ab50598 Goat anti-rabbit IgG(H&L) TRIT，用 PBS 或 FBS 配制。浓度1：20011. 加入二抗，室温孵育1 小时(避光)。12. 冰1%Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PBS洗一次，5分钟，于摇床。13. DAPI 染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。14. 冰1%Tween洗两次，每次5分钟，于摇床。冰PB
3、S洗一次，5分钟，于摇床。15. 加入防荧光淬灭封片剂，避光。16. 上机 confocol建议： 1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题， 再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会淬灭的。 2.荧光的片子一定要避光保存 保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。 3.二抗用之前一定离心，不然有的时 候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。 4.不管采用何种 方法，在使用 PBS 缓冲液漂洗时，如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时间。细胞爬片免疫荧光实验步骤第一天：1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3mi n
4、；2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15mi n，PBS浸洗玻片3次，每次3mi n；3. 0.5%Triton XTOO（ PBS配制）室温通透20mi n （细胞膜上表达的抗原省略 此步骤）；4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min,吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊 血清，室温圭寸闭30min；5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒, 4C孵育过夜；第二天：6. 加荧光二抗：PBST浸洗爬片3次，每次3mi n,吸水纸吸干爬片上多余液 体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37C孵育1h，PBST浸洗切片3次，每 次3mi n；注意：从加荧光二抗起，后面
5、所有操作步骤都尽量在较暗处进行。7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5mi n,对标本进行染核，PBST 5mi nX4次洗去 多余的DAPI； 8.用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封 片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。细胞免疫荧光步骤1.在 24孔板里加 500微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以 30-50%汇合 度较好。10000-30000左右2给药处理24h。3.PBS洗三遍。4. 4%冷的多聚甲醛固定15分钟，PBS洗三遍，每次5min，摇床。（避 光）5.0.5%Triton X - 100 （ PBS 配）破膜 15min , PBS 洗三遍，每次 5min
6、 , 摇床。6.5%BSA （牛血清白蛋白，PBS配）封闭60分钟，不用洗。7加一抗孵 育（5%BSA配），4摇床过夜。8收集一抗，PBS洗三遍，每次5min，摇床。孵育二抗Alexa Fluor 488 (1:1000 )，室温 60min (避光)9. 回收二抗，PBS洗三遍，摇床，每次5min。10. 0.5ug/mLDAPI( 5%BSA 配，2 滴/ml)染核 15min。(避光)11. PBS洗三遍，每次5min，摇床。12. 取载玻片，滴加10uL抗荧光衰减封片剂，将爬片有细胞面盖在封片剂上，指甲油封片子的对角线。All steps for IF1) Remove culture
7、 medium and fix cells (a common fixative is 4%formaldehyde in PBS, for 15 minutes)2) Wash well in PBS (3 x 5 minutes is typical)3) Permeabilize the cells (a common permeabilization reagent is 0.2% Trito n X-100 in PBS for 30 minutes)4) Wash well in PBS5) (optio nal: Block for non-specific dye bindin
8、g using the Image-iT FX Image Enhan cer Soluti on, 136933)6) Block for non-specific antibody binding 3060 minutes (a common blocking solution would be 36% bovine serum albumin / 5% normal goat serum / PBS, or commercial bloc king reagents like our BlockAid, product B10710)7) Incubate in primary anti
9、body for 3060 minutes, in blocking solution or overnight at 4 degrees (antibody concentr ations vary, but usually between 0.5-10ug/mL)8) Wash well in PBS9) Incubate in secondary antibody for 30-60 minutes, in 36% bovine serum albumin / PBS (a good starting antibody concentration is 5 ug/mL) 10) Wash well in PBS11) Counterstain as needed (such as with DAPI, D1306)12) Mount in appropriate mounting medium (for fluorescent secondaries, a go od antifade solution is best, such as ProLong Gold, P36934, or SlowFade Gold, S36937)
