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1、一、PCR技术及步骤聚合酶链式反应（PCR）PCR扩增产物的克隆上述两个实验包含基本原理、步骤、问题等。二、PCR常见问题汇总1. 没有得到扩增产物（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95加热5-10分钟。（5）引物变质失效。
2、人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。（6）使用PCR试剂盒时还应注意：是否严格按照说明书操作；试剂使用前是否充分混匀；试剂储存过久或不当而失效。2. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。（4）循环次数过多；增加模板量减少循环次数，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。（5）退火温度过低。（6）电泳体系有问题：凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；凝胶没有凝固好；琼脂糖质量差。（7）若为PCR试剂盒则可能：由于运输储存不当引起
3、试剂盒失效；试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。（8）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。3. 溴酚蓝前有区带（很宽）（1）模板量太低。增加模板DNA的用量。（2）循环次数太多。减少循环次数。（3）复性度偏低。提高复性温度。（4）预变性后没有立刻上机循环。（5）引物3端是否互补；重新设计合成较长的引物。（6）引物用量偏多。降低引物的使用量。4. 扩增产物出现多条带（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。（4）退火温度偏低，退火及延伸时间
4、偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。（5）样品处理不当。（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。5. PCR假阳性结果（1）引物设计不当，应调换引物。（2）循环参数不合适，导致非特异性扩增。（3）靶序列的交叉污染。6. PCR假阴性结果（1）引物长度不够。（2）试剂浓度不标准。（3）靶序列如突变、缺失等。（4）循环参数设置错误。（5）标本中有Taq酶抑制剂。（6）PCR产物检测系统灵敏度不够。三、PCR经验总结1. 增加PCR的特异性（1）引物设计这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单
5、一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件：a 足够长，18-24 bp，以保证特异性.当然不是说越长越好，太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量；b GC% 40%60%；c 5端和中间序列要多GC，以增加稳定性；d 避免3端GC 富集， 最后3个BASE不要有GC，或者最后5个有3个不要是GC；e 避免3端的互补，否则容易造成二聚体。f 避免3端的错配；g 避免内部形成二级结构；h 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5端,，在算Tm值时不需要加上这些序列，但在检测互补和二级结构是要加上它们；i 需要使用兼并引物时，要参考密码子使用表,注意生物的偏
6、好性，不要在3端使用兼并引物，并使用较高的引物浓度(1 uM-3 uM)；j 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.* 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55 到70 。退火温度一般设定比引物的 Tm低5 。设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18
7、碱基的引物。有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和 相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5 ，以2 为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5 ，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，
8、将退火温度设定为比最低的Tm低5 或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。（2）引物的稳定性定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100 M。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。 引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20 。以大于10 M浓度溶于TE的引物在 -20 可以稳定保存6个月，但在室温（15 到30 ）仅能
9、保存不到1周。干粉引物可以在-20 保存至少1年，在室温（15 到30 ）最多可以保存2个月。（3） 优化试剂浓度a. 镁离子Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性一般的情况下 Mg的浓度在0.5-5 mM之间调整同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度对实时定量PCR，使用3到5 mM带有荧光探针的镁离子溶液。b. 其他的离子NH4+K+都会影响PCR。增加K+的浓度后，会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度，从而降低了PCR的严谨性(stringency)。NH4+也有相同的作用.。MBI公司的T
10、AQ酶就提供了两种BUFFER，一种是加Mg的一种是已经混合了(NH4)2SO4的。当然， 过高的阳离子浓度(KCL0.2 M)时，DNA在94度根本不会发生变性，当然也就无从谈起PCR了。c. 聚合酶不同公司的酶效有所不同，需要实验者自己掌握适合的酶的浓度。一些高保真酶的效率要远远低于Taq polymerase，所以可能需要的酶的量也要大一些。另外， 一般的情况下，变性的温度可以使用9092度，变性的时间也可以缩短，从而保证聚合酶的活性。d. 模板50ul PCR SYSTEMhuman gDNA 0.1 ug-1 ugE.Coli 10 ng-100 ngLamadaDNA 0.5 ng
11、-5 ngPlasmid DNA 0.1 ng-10 ng（4）温度a. 变性常规是94度5分钟，GC 富集的摸板是95度5分钟，除了GC富集外，常规的操作可以将这部分时间缩短到1到2分钟，或者在循环1时给予较长的时间，而取消开始的变性。b. 退火重点到了。一般情况下，是从55度开始，根据情况配合以Mg离子浓度进行调整。有条件的可以做梯度pcr。 退火的时间在30-60 S，时间短一些可以得到更好的效果。因为聚合酶在退火温度时时也会有一些活性。所以在A.T.的时间过长，会极大的增加非特异性扩增的风险。另外，在对于一些困难户，比如从gDNA里扩增大片段，还可使用二步PCR。（5）touchdow
12、n PCR原理很简单，但的确是一个很有用的方法。举个例子就OK，退火温度55度94 5 min94 30 s60 30 s72 1 min 2cycles94 30 s59 30 s72 1 min 2cycles94 30 s58 30 s72 1 min 2cycles.94 30 s51 30 s72 1 min 2cycles94 30 s50 30 s72 1 min 20cycles72 5 min（6） 热启动 PCR热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配
13、制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法 简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合 酶，在反应体系达到90度时，暂停，将温度保持在70度以上，手工加入聚合酶，但这
14、个方法 过于烦琐， 尤其是对高通量应用，并容易造成污染。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本 成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时， 因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。有很多公司提供这样的酶。ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)Magnesium wax beads (Stratagene)象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。还有一种方法是使用灭活的DNA聚合酶，聚合酶被抗体抑制失活，当变性温度超过70度时，抗体也变性了，这样聚合酶又被激活了。（7）booster PCR我们知道1 ug 人基因 DNA 大约在3X105幂个模板分子，这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合。当模板的浓度过低，比如低于100个分子时，引物和模板之间就很难发生反应，引物容易自身进行反应形成二聚体，这样就有来了个 booster PCR， 我一直找不
