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1、蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义.、八、-前言蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧芽胞杆菌，在自然界分布广泛。在植物、许多生熟食品 上均能分离到，例如乳制品、禽畜类制品、蔬菜、汤汁、淀粉类制品等。污染食品后，在20C 45C, pH4.99.3条件下可以迅速繁殖并产生大量肠毒素。该菌引起的食物中毒的食品感官 性状均无明显变化，除食品有发粘、稍有异味无明显腐败变质现象，容易被人忽视。当一次 摄入食品中细菌数量达到100万/ g （ml）,即可发生食物中毒。特性：生物学性状，革兰氏阳性大杆菌，菌体两端较平整，多数呈链状排列。芽胞呈 椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端，芽胞囊不突出菌体。引起食物中毒的菌株多为周毛
2、 菌，有动力，不形成荚膜；培养特性，需氧菌，最适生长温度28 C35C,最适pH7.0 7.4，营养要求不高。在普通培养基上生长的菌落较大，直径3mm10mm,灰白色，不透明， 表面粗糙成毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐，呈扩散状。在血平板上形成浅灰色、不透明呈 毛玻璃状的菌落，有草绿色溶血环或完全溶血环。在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP ）培养基菌 落为粉红色（不发酵甘露醇）， 周围有粉红色的晕（产生卵磷脂酶）。在普通肉汤中呈混浊生 长，常形成均膜或壁环；生化性状，卵磷脂酶、酪蛋白酶、过氧化氢酶、青霉素酶、明胶 液化、硝酸盐还原试验均阳性。溶血。不发酵甘露醇、木糖、阿拉伯糖。实验安排一、稀释菌悬液的
3、制备：二、细菌接种：不发酵甘露醇，且产生卵磷脂酶的细菌。（在MYP培养基上呈粉红色，周围 有粉红色晕的菌落。三、菌数测定：四、形态学观察：肉汤培基、营养琼脂培基、革兰氏染色、动力。五、生化试验：酪蛋白酶、硝酸盐还原酶、明胶酶、过氧化氢酶阳性第一部分用灭菌生理盐水将检样作成10-110-5的稀释液。取每个稀释度0.1ml接种在甘露醇卵黄 多粘菌素（MYP）琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置于321C温箱培养1220h。一、稀释菌悬液的制备：1. 每组取5支高压灭菌的玻璃试管，用10ml吸管吸取9ml生理盐水分别加入5支试管 之中。2. 用1ml的吸管吸取样品液1ml,加入第一支玻璃试管中，
4、吹打混匀。3. 再用此吸管吸取该试管中的菌悬液1ml，加入第二支玻璃试管，吹打混匀。依此类推。二、细菌接种：用 0.1ml 吸管于从最高稀释度管（ 10-5）开始分别吸取菌悬液 0.1ml 于甘露醇卵黄多粘菌 素（MYP）琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置321C温箱培养2048h。第二部分一、观察 MYP 培养基上的菌落在 MYP 培养基上，呈粉红色（表示不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕（表示产生卵磷 脂酶）的菌落可能为蜡样芽胞杆菌。二、菌数测定选取适当菌落数的平板进行计数。计数后，从中挑取 5 个此种菌落做证实试验。根据证 实为蜡样芽胞杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数，然后乘以其稀
5、释倍数，即得每g （或 ml）样品中所含蜡样芽胞杆菌数。例如MYP平板的可疑菌落为25个，取5个鉴定，证实为 4个，乘上稀释倍数（如10-4）的倒数，再乘上1g （或ml）检样数（取的是0.1ml样）则为: 25 X 4/5 X 1/10-4 X10=2X106三、普通肉汤及血琼脂培养每组挑取该平板中的 5 个菌落，将每个菌落分别接种于普通肉汤培养基、普通营养琼脂 培养基、血琼脂平板上，35C培养1824h。第三部分 一、观察普通肉汤培养基、普通营养琼脂培养基、血琼脂平板上细菌的生长状况在普通琼脂培养基上生长的菌落较大，直径3mm10mm，灰白色，不透明，表面粗糙 成毛玻璃状或融蜡状，边缘不整
6、齐，呈扩散状。在血平板上形成浅灰色、不透明呈毛玻璃状 的菌落，有草绿色溶血环或完全溶血环。在普通肉汤中呈混浊生长，常形成菌膜或壁环。、形态学观察（革兰氏染色）初染液：结晶紫或龙胆紫。媒染液：卢戈（Lugo 1）碘液。脱色液： 95%乙醇。复染液：石炭酸复红稀释液常规制备涂片：涂片干燥 固定。初染：将结晶紫液覆盖菌膜，染1 min,水冲洗。媒染：滴加卢戈氏碘液数滴染1 min,水冲洗。两者生成结晶紫-碘复合物。 脱色：滴加脱色液乙醇后，频频倾动玻片 0.5 min ，见无紫色脱下立即用水冲洗。复染：滴加复染液染1 min,水冲洗，待干，镜检。 形态观察：革兰氏阳性大杆菌，菌体两端较平整，多数呈链
7、状排列。芽胞呈椭圆形，多 位于菌体中央或稍偏于一端，芽胞囊不突出菌体。三、生化试验1. 点种酪蛋白琼脂平板。32C培养48h。2. 动力和硝酸盐还原试验：取菌落穿刺接种于动力-硝酸盐半固体高层培养基，32C培养 48h。3. 明胶液化试验：用接种针挑取少许可疑菌落，穿刺接种木糖-明胶培养基，32C培养 1824h。第四部分一、观察生化试验结果1. 点种酪蛋白琼脂平板（结果）：在菌落周围有透明圈形成（产生酪蛋白酶），为阳性。2. 动力和硝酸盐还原试验（结果）：如细菌不限于沿穿刺线生长，并伴有混浊，即表示 有动力；然后，分别加入对氨基苯磺酸和a -萘胺等量混合液0.1m 1，如立即或10min内出现 红色，即表示能还原硝酸盐，硝酸盐还原酶阳性。3. 明胶液化试验（结果）：蜡样芽胞杆菌可液化明胶。4. 触酶（过氧化氢酶）试验：挑取少许可疑菌落置于一载玻片上，加 3%过氧化氢溶液 一滴。如有气泡产生，为触酶阳性。二、撰写实验报告
