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1、生物显微技术 讲稿2010 2011 学年第 1 学期学 院生命科学学院系(实验室)生物工程系课 程 名 称生物显微技术授 课 班 级生物30801、30802主 讲 教 师马立安职 称教授使 用 教 材植物显微技术备注生物显微技术 （1 h）学时：30学时，学分：1.5，适用专业：生物工程考查课，考核办法：考勤及实验操作60 %；实验报告40 %一、实验目的与任务 要求学生掌握制片的原理和主要方法，培养学生应用显微技术解决科研、生产问题的能力。提高学生动手、实践和运用现代科学仪器的能力等综合素质。二、生物制片的一般原理及方法植物制片技术是植物显微技术课的一个重要组成部分，是研究植物细胞学、解
2、剖学、胚胎学的必要技术基础。在有关植物形态建成、植物杂交育种、作物病虫害防治、药用植物的培育和鉴别以及林木材性鉴定等多方面的研究和教学工作中，都需要应用显微制片技术，由于各种作物器官的性质差异以及研究目的的不同，就需要不同的制片方法。三、植物制片分类（一）按制片方法可分为二大类：1、切片法（1）徒手切片法 指手拿刀片把植物新鲜材料切成薄片，所作的切片通常不经染色或经简单染色后，制成临时的水装片用于观察。方法简便，要求设备简单，但徒手切片技术要求熟练，方可切出符合要求的薄片。（2）石蜡切片法 以石蜡作包埋剂。用旋转切片机将材料切成薄片（一般为812 m，可以切成连续的蜡带），经一系列处理制成永存
3、片。便于进行器官的三维重构。切片厚度比较好掌握。此法多用手摇切片机切片。（3）半薄切片法 方法步骤与石蜡制片相似，但包埋剂为塑料或环氧树脂，采用玻璃刀或钢刀，切片厚度为12 m，不能切成连续的蜡带。（4）冰冻切片法 将待切材料快速冷冻，或固定以后再冷冻，用冰冻切片机切片，用于做原位杂交、组织化学等。（5）滑走切片机切片法 是利用滑走切片机切新鲜的或保存的材料，亦可以切经由石蜡制片法包埋的材料。 将材料夹持于夹持物中（如石蜡、火棉胶、胡萝卜等，木材软化后可直接切片），并固定于滑走切片机夹物台座上进行切片，此法切出的切片厚薄均匀、结构完整，适用于一些比较坚硬的材料。（6）超薄切片法 用超薄切片机制
4、作超薄切片，切片厚度为500 左右，供电子显微镜观察用，技术要求更严格。长江大学生命科学学院备课用纸长江大学生命科学学院备课用纸备注2、非切片法（1）离析法 用一些化学药品或酶等使细胞间的胞间层溶解，细胞彼此分离，从而得到单个、完整细胞的方法，便于研究细胞的立体结构。该方法适用于木材导管、根尖、茎尖及叶表皮细胞及木材、药材的研究。（2）压片法 经化学药剂处理植物的器官或组织并用手工机械地使植物细胞分离，涂抹或压在载玻片上，使细胞成一薄层，便于进行观察的一种制片方法。如染色体压片法。（3）整体封藏法 将完整细小的组织块进行处理，封藏为永存片，如叶表皮整体制片、团藻、水绵、黑根霉等装片。（4）整体
5、透明法 用透明剂将较小的材料整体透明，经透明以后可以在显微镜下观察其内部结构。（5）胚囊酶法分离技术 对植物的胚珠进行酶解，将胚珠内部的完整胚囊分离出来，用于研究胚囊的发育、或者进一步分离出卵细胞。（二）按是否能长期保存来分，可分为二类：（1） 临时制片法：制片用于临时观察，不需要长期保存（如临时装片、徒手切片、冰冻切片等）。（2）永存片制片法：制片可以长期保存（如石蜡切片、半薄切片、超薄切片等）。四、教学基本要求1、要求重点掌握的技术：石蜡制片技术(包括：取材、固定、脱水、包埋、切片、展片、烤片、染色、透明与封藏)；2、要求掌握的一般技术：(1) 植物其它切片制片方法（徒手切片法）；(2)
6、非切片制片技术（压片法、涂片法、整体透明法、酶解法等）(3) 摄影及照相机的使用方法；长江大学生命科学学院备课用纸长江大学生命科学学院备课用纸备注五、实验项目、类型及学时分配实验内容 总学时30周次课序实验内容学时21实验一 生物制片样品的选取与固定技术2中秋节、国庆节放假72实验二 植物显微化学制片2实验三 生物样品的非切片制片法283实验四 植物组织分离制片蚕豆叶表皮制片数码显微拍照技术494实验五 石蜡切片（）样品的脱水、透明与浸蜡8105实验六 石蜡切片（）样品的包埋2116实验七 石蜡切片（）石蜡包埋样品的切片、粘片与展片5127实验八 石蜡切片（）石蜡切片样品的染色技术5班级上课时
7、间安排周次时间班级地点2712周六8：3011：50生物30801、02西1-209要求：1、预习：了解本次实验课的原理及主要内容、操作步骤。2、写好实验报告：简写目的、原理、；详写重要实验步骤；先思考作业题。3、带上已写好的实验报告进教室4、提问：上课老师提问，根据疑点、难点进行重点讲解。5、当堂课交报告：实验做完，完成作业及思考题后交上实验报告。备注实验一 生物制片样品的选取与固定技术 （2 h）一、实验目的要求了解生物制片样品的选材与固定技术，为石蜡切片做准备。二、实验原理1、选材与切割：根据不同制片目的和制片方法选取合适的材料；材料要求新鲜，无病虫害；先作徒手切片或剥离检查，决定适宜的
8、材料立即固定处理；材料大小要适当，如根的直径在5 mm 以内的，可切取5-10 mm 长的小段，直径在5 mm 以上者可纵分割成12 或14，横切厚度约3-5 mm；叶的切割可切成2-5 mm，若叶较宽可切10 mm 的长条，叶面切取的部位，以研究者的目的灵活选取。切取材料必须使用新刀片，刀口和叶面垂直迅速切割下来；花、果的切割：花药和雌蕊切割，花芽和幼穗的切割，须剥去外部鳞片及叶鞘和其它部分，切去多余部分再放入固定液，有的花序则需去掉外方苞片，一般小的花不经切割可投入固定掖，大花果才进行分割处理。2、杀生（杀死）：在制片过程中，将拟制片的材料（细胞或组织块）迅速杀死，使组织块尽量保持原生活时
9、状态，这种处理通称杀生。杀生时常用一种或多种化学药品处理。一般以渗透力较强的药剂作杀生剂效果比较好。3、固定：在杀生处理的过程中，将器官、组织、细胞按原来的形态保存下来，并为后续制片保持固有形态，这样才达到固定的要求。杀生与固定关系密切，通常二者兼有作用。4、保存：组织块经杀生固定后，能较长时间保存下来，经久保存下来的组织块，仍能制片，如酒精、醋酸，福尔马林液保存时间较长；而铬酸类固定液，常须转换70 %酒精液后保存，才可较长时间保存。三、实验材料与试剂材料：南瓜茎或禾木植物的茎试剂：1、F.A.A 固定液（福尔马林冰醋酸酒精）（1）福尔马林（38 %甲醛） 5 mL（2）冰醋酸 5 mL （
10、3）70 %酒精 90 mL2、F.P.A 固定液（福尔马林丙酸酒精）制片效果有时较F.A.A 好。（1）福尔马林（38 %甲醛） 5 mL （2）丙酸 5 mL （3）70 %酒精 90 mL3、Canoys Fluid （卡诺氏固定液）（1）纯酒精（或95 酒精） 15 mL （2）冰醋酸 5 mL长江大学生命科学学院备课用纸长江大学生命科学学院备课用纸1四、实验操作步骤1、取样：用锋利刀片将南瓜茎切成小段，用作横切的切成0.8 cm长，用作纵切的切成1 cm长，并切去相对两侧少许，最好选择髓腔较大的样品纵切为两半，髓腔较小的样品不用纵切；2、固定：用FAA固定24 h，抽气，除去材料中的
11、气体，并保存于固定液中；3、软化：先经70 %、50 %、30 %酒精及降至蒸馏水(每次瓶装1/3试剂)分别处理2-4 h后，置于15 %氢氟酸中软化10-15 d备用。氢氟酸可将硅化物软化去除南瓜茎表面的硅化物颗粒，便于制片。思考题与参考文献思考作业：1、 生物制片如何选择材料？2、杀生和固定有何意义？参考文献：1、王灶安植物显微技术北京：农业出版社，19922、李和平植物显微技术华中农业大学，2006电子版3、李正理植物组织制片学北京：北京大学出版社，1996长江大学生命科学学院备课用纸备注实验二 植物显微化学制片 （2 h）一、实验目的要求掌握植物徒手切片的制作技术与方法。利用临时装片进
12、行显微化学鉴定，掌握常用植物显微化学实验的原理与方法。二、实验原理植物显微化学：将材料以徒手切片方法制成薄片，应用化学反应或染色与化学反应相结合的方法，将组织或细胞内的某种化学成分（淀粉粒、蛋白质、脂肪、果胶质、纤维素及木质素等）在组织切片内予以显示。用于研究和测定植物的器官、组织及细胞中内含物的存在、化学性质、含量和分布，简便迅速的方法，是野外调查和室内鉴定的极好方法。三、实验材料与试剂材料：土豆试剂：碘-碘化钾溶液：（1）碘化钾 2 g；（2） 碘 1 g；（3）蒸馏水 300 mL配法：先将碘化钾加热溶于5 mL 蒸馏水中，然后加入碘，待其溶化后再将溶液稀释至300 mL。四、实验操作步
13、骤1、制作土豆临时装片：徒手切片法制作（1）将材料切成长约23厘米的小段，削平切面。（2）左手的三个指头拿住材料，使之固定不动摇。为防止刀伤，材料上端应超出手指23 mm，不可高出过多，否则切片时材料容易动摇，也不容易切薄。（3）右手大拇指和食指捏住刀片的右下角（刀片要非常锋利，双面刀片必须是新用的），刀口向内，并与材料切面平行，切片前先将材料和刀口上蘸些水，使之切时滑润。长江大学生命科学学院备课用纸（4）切的方法，以刀口自外侧左前方向内侧右后方拉切，这样可以边切边看清切片的进展情况，同时切起来也比较顺手。切片时只用臂力而不要用腕力及握刀指关节的力量，左手保持不动，不要两手同时拉动，两手不要紧
14、靠身体或压在桌子上，并且动作要敏捷，材料要一次切下，切忌中途停顿或推前拖后作“拉锯”式切割。关键是要切得薄而平。如此连续切片，切下数片后，用湿毛笔将切片轻轻移入培养皿的清水中备用。（5）在切片过程中刀口和材料要不断蘸水，以保持刀口锋利和避免材料失水变形。所切的材料和刀片一定要保持水平方向，不要切斜，如果切斜，即使很薄，但由于细胞切面偏斜，同样影响观察。（6）切下足够多的切片后，挑选薄而平的切片做成临时装片供镜检。挑选切片时，不一定要材料切得很完整，只要切得很薄就行，有时只要有一小部分就可以看清其结构了。因此切下的切片不是每一片都适用，也不是只有全面切得薄的才能用，要根据需要进行选择，一次可多选几片置于载玻片上，制成临时装片，通过镜检再进一步选择理想的材料用以观察。2、染色：I2-KI溶液染色，取一滴配好的溶液滴在切片材料上染色30 S，水洗；3、观察：盖上盖玻片置显微镜下观察，可见细胞内含许多被染成蓝色的卵圆形或椭
