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1、大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增。1. 取1.5ml细菌培养物于EP管中，4000rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉淀尽量干燥；2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100 l溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，剧烈振荡；3. 加入200 l新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1SDS（m/v）)，盖紧EP管口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要涡旋，置于冰浴中；4.
2、加入150 l预冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml H2O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上35分钟；5. 在最大转速下离心5min，取上清液于另一新EP管；6. 用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，最大转速离心5分钟；7. 小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽；8. 加1ml 70乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中
3、内没有可见的液体存在（510分钟），用适量的ddH2O溶解；9. 用0.5l的RNase 37温育510分钟；10. 电泳鉴定。乙醇沉淀DNA1. 加入1/10体积的乙酸钠（3 molL，PH=5.2）于DNA溶液中充分混匀，使其最终浓度为0.3 molL；2. 加入2倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20中1530分钟；3. 12,000 g离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；4. 加入1/2离心管容量的70乙醇，12000g离心2分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；5. 于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干；6. 加适量的ddH2O溶
4、解DNA沉淀。酶 切1. 酶切前确定待切样品的浓度, 并选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。2. 在离心管中加入如下成分：10Buffer 1l 待切样品 xl酶 0.5-1l 加水补足10l3. 混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。4. 将离心管置于37中温育1-3hr，若待切样品为PCR产物，则可将反应时间适当延长。5. 用未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。注：当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比例适当加大反应体积。双酶切可选用二者活性都较高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反应。）连 接1. 连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。2. 在离心管中加入
5、如下成分：10连接Buffer 1l 待连接的样品（胶回收产物或PCR产物，载体与片段的mol比为13-5）连接酶0.5-1l 加水补足10l3. 混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。4. 将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间（根据不同公司的酶的要求而定，一般为22 1-3hr或16连接过夜）。连接完的样品可直接用于转化，也可放4冰箱短期保存。感受态细胞的制备1. 挑取适当菌株的E.coli 单菌落接种于2ml SOB培养液中，37摇床过夜。2. 取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50ml SOB中，18剧烈震荡，直到A600达到0.6。3. 将培养物转移到50ml离心管中，4 4,
6、000rpm/min离心10min。同时在冰浴上配置TB溶液。4. 弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。5. 取1ml刚配的TB溶液打散菌体沉淀，再加入15ml TB（1/3体积的起始培养液），冰浴10-15min，4 4,000rpm/min离心10min。6. 弃上清，沉淀重悬于4ml TB（1/12.5体积的起始培养液），冰浴10min。7. 加入280l DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴10min。8. 将菌液分装于EP管中，-80或液氮冻存。9. 取两管感受态细胞分别加入1l无菌ddH2O（阴性对照）和1l纯质粒（阳性对照）进行转化（见后），以检测感受态
7、的质量。阴性对照平板上应该无菌落生长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。SOB的配制：蛋白胨 20g酵母提取物 5gNaCl 0.58gKCl 0.186g100Mg+溶液 10ml溶解并加水定容至1L，12120min高压蒸汽灭菌100Mg+溶液： MgCl26H2OMgSO47H2O溶解并加水定容至100ml，12120min高压蒸汽灭菌TB溶液的配制： 1M KCl 5ml0.55M MnCl2 2ml0.5M CaCl2 0.6ml0.1M K-Pipes(pH 6.7) 2mlddH2O 10.4mlTotal 20ml注：上述溶液均需高压蒸汽灭菌处理0.1M K-P
8、ipes(pH=6.7)的配制： 称取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H2O中，此时粉末不能完全溶解，用10N KOH或KOH固体调节PH值，只有当PH接近6.7时粉末才能完全溶解，此时当小心少量地加入KOH直至达到所需PH值。转 化1. 取100l感受态细胞于冰浴上融化。2. 加入1l纯质粒或连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30 min。3. 将菌液放入42水浴中热激90秒，立即放入冰浴中2 min。4. 加入0.9ml SOC，于37恒温摇床上200rpm1hr温育。5. 将菌液4000rpm/min离心3min，留200l上清将菌体打散，均匀涂布于含适当抗生素的琼脂平板表面，平
9、板于37倒置培养过夜。i. 注：新倒的平板可于37培养箱中预先放置数小时至过夜干燥。ii. 当转化的是TA克隆连接产物时可在菌液中加入8l 1M IPTG和40l 20mg/ml X-gal以进行蓝白斑筛选。重组子的筛选和鉴定重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用扩增引物通过PCR进行鉴定，阳性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的PCR产物。1. 用牙签挑取平板上的菌落接种于2ml含适当抗生素的LB培养基中，37摇床培养过夜。2. 次日取菌液0.2-0.5ml，13,000rpm3min离心，弃上清，加入20l ddH2O和20l 酚/氯仿，震荡混匀，13,000rpm5min离心。3. 取
10、上清进行琼脂糖电泳，加入载体质粒DNA作为阴性对照，根据质粒大小初步筛选重组子，重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。4. 用碱法小量制备可能是重组子的质粒DNA。5. 选取适当的酶，对重组子进行酶切分析，酶切体积均为10l体系。酶切样品进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。6. 酶切分析正确的重组子分成两份，一份进行测序反应，另外一份保种。7. 若用PCR法鉴定，则在第2步时每个样本取0.5-1.0l 菌液为模板进行PCR反应，每管反应体系最低可少至10l，PCR产物电泳，能得到所需条带的样本进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。真核细胞的转染该操作以Invitrogen公司的脂质体转染试剂Lipof
11、ectAMINE为例，其它转染试剂可参照各自的使用说明书进行。1. 在6孔板中接种1-3105细胞/孔，加入2ml完全培养基，置CO2孵箱中37培养过夜。2. 待细胞长到50-80%单层时，在无菌离心管中配制如下溶液：i. 溶液A：将1-2g待转染的超纯DNA稀释到100l无血清培养基中ii. 溶液B：将2-25l LipofectAMINE稀释到100l无血清培养基中3. 混合溶液A和B，轻轻混匀，室温放置15-45min。4. 用2ml无血清培养基轻轻洗涤细胞，加入0.8ml无血清培养基/孔，将脂质体复合物滴加到孔中，轻轻摇晃混匀，置CO2孵箱中37孵育2-24hr。5. 用完全培养基替换
12、转染液，继续培养。6. 24-72hr后检测蛋白质的表达或传代并加入选择性抗生素以筛选稳定表达株。转染细胞的稳定筛选1确定抗生素作用的最佳浓度：不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度。1) 提前24小时在96孔板或24孔板中接种细胞8孔，接种量以第二天长成25%单层为宜，置CO2孵箱中37培养过夜。2) 将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（0, 50, 100, 200, 400, 600, 800 和1000g/ml）。3) 培养10-14天以绝大部分细胞死亡浓度为准,一般为400-800g/ml,筛选稳定表达克隆
13、时可比该浓度适当提高一个级别维持时使用筛选浓度的一半.2转染按前面的步骤进行。3转染72小时后按1:10的比例将转染细胞在6孔板中传代，换为含预试验中确定的抗生素浓度的选择培养基。在6孔板内可见单个细胞，继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆。1) 滤纸片法：用消毒的5x5mm滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上10-15秒，取出粘附有细胞的滤纸片放于24孔板中继续加压培养。细胞在24孔板中长满后转入25cm2培养瓶中,长满后再转入75cm2培养瓶中培养。2) 有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的10倍稀释（10-210-10），将每一稀释度的细胞滴加到96孔板中培养，7-10天后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。4. ELISA或Western blot检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种。 5. 相关帮助需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网进行咨询：http:/需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎：http:/
