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1、实训二 血清-球蛋白的分离纯化与鉴定目的要求 1了解蛋白质分离提纯的总体思路。 2掌握盐析法、分子筛层析法、离子交换层析等实验原理及操作技术。 实验原理 血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白和-球蛋白，其中-球蛋白含量约占16，100ml血清中约含1.2g左右。 首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离,沉淀部分即为含有-球蛋白的粗制品。 用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。常用的
2、方法有透析法、凝胶层析法等。本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。球蛋白、-球蛋白的PI4为止。加等体积lmol/L氢氧化钠溶液，使最终浓度约为0.5mol/L氢氧化钠，搅拌后放置30min，以虹吸除去上层液体。同上用蒸馏水反复洗至pH7为止。虹吸去除上层液体，然后加入0.0175mol/L磷
3、酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，备用。（4）0.0175molL磷酸盐缓冲液(pH6.3) A液：称取磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H20)2.730g溶于蒸馏水中，加蒸馏水稀释至1000ml。 B液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H20)6.269g，溶于蒸馏水中，加蒸馏水稀释至 1000mL。 取A液77.5ml，加于B液22.5ml，混匀后即成。（5）20%磺基水杨酸溶液（6）奈氏(Nessler)试剂应用液 贮存液；称取碘化钾(KI)7.58g于250ml三角烧瓶中，用蒸馏水5ml溶解，再加入碘（I2） 5.5g溶解，加77.5gHg用力振摇10min(此时产生高热，须冷却)，直至
4、棕红色的碘转变成带绿色的碘化汞钾液为止，过滤上清液倾入100ml容量瓶，洗涤沉淀，洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至100ml。 应用液：取贮存液75ml加10NaOH 350ml，加水至500mL。（7）0.9氯化钠溶液（8）乙酸纤维素薄膜电泳有关试剂(见实验29)2器材（1）人血清。（2）层析柱。（3）长滴管。（4）醋酸纤维素薄膜。 (5 )离心机操作方法1盐析中性盐沉淀取正常人血清2.0ml于小试管中，加0.9氯化钠溶液2.0ml，边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml，混匀后于室温中放置10min，3000rmin离心10min。小心倾去含有清蛋白的上清液，重复洗涤一次，于
5、沉淀中加入0.0175molL磷酸盐缓冲液(pH6.3)0.51.Oml使之溶解。此液即为粗提的球蛋白溶液。2脱盐凝胶柱层析（1）装柱：洗净的层析柱保持垂直位置，关闭出口，柱内留下约2.0ml洗脱液。一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内，打开柱底部出口，调节流速0.3ml/min。凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部，最后使凝胶床达20厘米高，床面上保持有洗脱液，操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”。在凝胶表面可盖一园形滤纸，以免加入液体时冲起胶粒。（2）上样与洗脱：可以在凝胶表面上加圆形尼龙滤布或滤纸使表面平整，小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下
6、降至凝胶床表面，关紧下端出口，用长滴管吸取盐析球蛋白溶液，小心缓慢加到凝胶床表面。打开下端出口，将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内。关闭出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁。打开下端出口，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次，以洗净内壁上的样品溶液。然后可加入适量缓冲液开始洗脱。加样开始应立即收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵，流速为0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。（3）洗脱液中NH4+与蛋白质的检查：取比色板两个(其中一个为黑色背底)，按洗脱液的顺序每管取一滴，分别滴入比色板中，前者加20磺基水杨酸溶液2滴，出现白
7、色混浊或沉淀即示有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度；于另一比色板中，加人奈氏试剂应用液l滴，以观察NH4+出现的情况。 合并球蛋白含量高的各管，混匀。除留少量作电泳鉴定外，其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。3纯化DEAE纤维素阴离子交换层析用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度，并用0.0175molL磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱、分管收集。用20磺基水杨酸溶液检查蛋白质分布情况。(装柱、上样、洗脱，收集及蛋白质检查等操作步骤同凝胶层析)。4浓缩经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的球蛋
8、白液往往浓度较低。为便于鉴定，常需浓缩。收集较浓的纯化的球蛋白溶液2m1，按每ml加0.2 0.25gSephadex G一25干胶，摇动23min， 3000rmin 离心5min。上清液即为浓缩的-球蛋白溶液。 5鉴定乙酸纤维素薄膜电泳取乙酸纤维素薄膜2条，分别将血清、脱盐后的球蛋白、DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的-球蛋白液等样品点上。然后参阅实验二十九：乙酸纤维薄膜电泳法进行电泳分离、染色。比较电泳结果。注意事项1凝胶及DEAE纤维处理期间，必须小心用倾泻法除去细小颗粒。这样可使凝胶及纤维素颗粒大小均匀，流速稳定，分离效果好。2装柱是层析操作中最重要的一步。为使柱床装得均匀，务必做到凝
9、胶悬液或DEAE纤维素混悬液不稀不厚，一般浓度为l：l，进样及洗脱时切勿使床面暴露在空气中，不然柱床会出现气泡或分层现象；加样时必须均匀，切勿搅动床面，否则均会影响分离效果。3本法是利用-球蛋白的等电点与-、-球蛋白不同，用离子交换层析法进行分离的。因此层析过程中用的缓冲液pH要求精确。4电泳注意事项见实验二十九。5凝胶贮存：凝胶使用后如短期不用，为防止凝胶发霉可加防腐剂如0.02叠氮钠。保存于4冰箱内。若长期不用，应脱水干燥保存。脱水方法：将膨胀凝胶用水洗净。用多孔漏斗抽干后，逐次更换由稀到浓的乙醇溶液浸泡若干时间，最后一次用95乙醇溶液浸泡脱水，然后用多孔漏斗抽干后，于6080烘干贮存。6
10、离子交换剂的再生和保存；离子交换剂的价格较贵，每次用后只需再生处理便能反复使用多次。处理方法是：交替用酸、碱处理，最后用水洗至接近中性。阳离子交换剂最后为Na型，阴离子以Cl型是最稳定型，故阴离子交换剂处理顺序为碱一水一酸一水。由于上述交换剂都是糖链结构。容易水解破坏，因此须避免强酸、强碱长时间浸泡和高温处理，一般纤维素浸泡时间为3-4h。 离子交换剂容易长霉引起变质，不用时，需洗涤干净，加防腐剂置冰箱内保存。常用0.02叠氮钠防腐。叠氮钠遇酸放出有毒气体，也是剧毒与易爆的危险品。使用时要加倍小心。 除用凝胶层析法去除无机盐类外，最常用的去盐法就是透析。细的透析袋效率高，所需时间短。将透析袋一
11、端折叠，用橡皮筋结扎，试验是否逸漏，然后倒入待透析的蛋白质溶液。勿装太满，将袋的上端也结扎好，即可进行透析。开始可用流动的自来水，待大部分盐被透析出后，再改为生理盐水、缓冲液或蒸馏水。透析最好在较低的温度下，并在磁力搅拌器上进行。此法简单，易操作，仪器及试剂要求不高，但不如凝胶层析法效率高。 浓缩-球蛋白粗提液除上述方法外还可用透析袋浓缩。将待浓缩的蛋白质溶液放入较细的透析袋中，置入搪瓷盘内。透析袋周围可撒上聚乙二醇6000(PEG6000)，或聚乙烯吡咯酮，或蔗糖。以上物质在使用后(吸了大量水)都可以通过加温及吹风而回收；将装有蛋白质溶液的透析袋悬挂起来，用电风扇高速吹风(10以下)，也可达到浓缩目的，以上两法虽不如 SephadexG一25干胶快，但价格较便宜，方法也不烦琐。
