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1、microRNA的实时定量茎环RT-PCR技术摘要： 已开发出一种新型的microRNA（miRNA）的定量方法，即利用茎环反转录，Taqman PCR分析。茎环RT引物在RT 效率和特异性方面比传统的更好。TaqMan miRNA的检测是很具体的，可以检测成熟miRNA和区分相关的甚至低至一个核苷酸的miRNAs。此外，他们不会受到基因组DNA污染的影响。精确量化可以从低至25皮克的总RNA中提取大多数miRNA。事实上，这种方法灵敏度高，特异性强和精密度高，允许无需核酸纯化，直接分析单个细胞。如标准TaqMan基因表达分析，TaqMan miRNA的检测显示出了7个数量级的动态范围。七个小
2、鼠组织中五个miRNA定量显示，在每个细胞中，有低至10到超过30000个拷贝数。这种方法可以确保快速，准确，灵敏miRNA表达谱，并能识别和监控特定组织或疾病的潜在生物标志物。茎环RT-PCR可用于其他小RNA分子，如短干扰RNA（siRNAs）的量化。此外，为更好的特异性和效率，茎环RT引物设计的概念可以应用在小分子RNA克隆和多重检测。引言： miRNA是自然发生的，高度保守的转录家庭，来源于较大的发夹前体。miRNA是在动物和植物的基因组上发现的。到目前为止，有1000个独特的转录产物，其中，在桑格中心miRNA的注册表中包括326人类miRNA。 miRNA是通过催化mRNA的分裂或
3、抑制mRNA的翻译来调节基因表达。他们被认为在细胞发育，分化和传导中发挥着重要作用。具体职责包括调节细胞增殖和新陈代谢，发育时间，细胞死亡，造血，神经发育，人类肿瘤形成与DNA甲基化和染色质修饰。 虽然miRNA的相对丰富的转录产物类别，其表达水平在物种和组织之间相差很大。低丰度的miRNA经常逃避检测技术，如克隆，Northern杂交和基因芯片分析。这里，我们提出一种新型实时定量方法，能够准确灵敏地检测miRNA与其他小分子RNA。这种方法扩展了实时PCR技术，从大分子的基因表达到微分子的变化检测。材料和方法 从桑格中心的miRNA注册网站 http:/www.sanger.ac.uk/So
4、ftware/ Rfam/mirna/index.shtml中筛选目标，引物和探针。所有TaqMan miRNA检测，可通过应用生物系统公司（P / N4365409）得到。miRNA标准TaqMan分析，采用PrimerExpress软件设计PRI-LET-7A-3和PRI-MIR-26B和miRNA前体miR-30A。所有序列在补充资料部分可用。合成miRNA的寡核苷酸从Integrated DNA Technolo-gies (IDT, Coralville, IA)购买。RNA样本组织，细胞，细胞裂解物和总RNA制备 从Ambion公司（P / N7810，7812，7814，7816
5、，7818，7824，7826和7968）购买10-12天老鼠的脑，心，肝，肺，胸腺，卵巢和胚胎的总RNA样品。 Ambion公司鼠的总RNA来自瑞士韦伯斯特小鼠。基于TaqMan基因表达分析人类或小鼠的3 - 磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）内对照（P / N4310884E4352339E，应用生物系统公司）所有的RNA样品进行标准化。 两个细胞株HepG2和OP9，培养，使用Gibco公司MEM（P / N 12492-021，Invitrogen，Carlsbad, CA）补充10胎牛血清（FBS）(P/N: SH30070.01, HyClone, Logan, UT)培养。用血球计对
6、胰酶消化细胞计数。约2.8106个悬浮细胞通过离心沉淀，1500r.p.m.离心5分钟，用1毫升不添加 MgCl2 and CaCl2的杜尔贝科的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。细胞再悬浮于140毫升PBS，并用三种不同的样品制备方法处理。第一种方法，一个50毫升的样本（106个细胞）等量的核酸纯化裂解液混合，用吸管反复吹打十次，然后旋转。在添加到RT反应体系前，将裂解液用1 U / ml的RNase抑制剂溶液稀释1/10。在第二种方法中，用mirVanamiRNA提取试剂盒提取50毫升的样本（106个细胞）。纯化的总RNA在100毫升洗脱缓冲液中洗脱。第三种方法用1PBS稀释1/2，95加热5分
7、钟，在加入RT反应体系前立即在冰上保存。用mirVana miRNA检测试剂盒检测miRNA 根据制造商的协议，使用mirVana-miRNA的检测试剂盒对miRNA杂交分析。由IDT合成RNA探针。放射性同位素标记的RNA片段用气旋存储荧光粉系统进行检测和定量。反转录酶反应 逆转录反应中包含的RNA样品，包括纯化总RNA，细胞裂解物，和热处理细胞，50纳米的茎环RT引物，1RT缓冲液，每dNTPs浓度0.25毫米，3.33 U / L 的逆转录酶和0.25 U / L的RNase抑制剂。7.5微升反应体系在9700温度循环器96- 或 384-平板上16培养30分钟，4230分钟，855分钟
8、，然后保持4。所有逆转录反应，包括无模板对照和RT负对照，都进行一次重复。PCR 采用标准的TaqManPCR试剂盒进行实时PCR。 10LPCR反应体系包括0.67LRT产物，1TaqMan Mix ，0.2M的TaqMan探针，1.5m M正向引物和0.7M反向引物。反应在 384-平台上95培养10分钟，9515秒601分钟40个循环。所有的反应一式三份。 C T为在荧光通过固定阈值的循环数。荧光定量CT值转换成绝对数量的拷贝数，使用合成林-4 miRNA的标准曲线。结果 我们提出了一个新的miRNA的定量的实时RT-PCR技术方案。它包括两个步骤：RT和实时PCR。首先，茎环RT引物是
9、与miRNA分子杂交，然后用Multi-Scribe反转录。接下来，用传统的TaqMan PCR，对RT产品进行定量。图1。上图描述的是TaqMan miRNA的检测原理，基于TaqMan实时定量miRNA的包括两个步骤，茎环RT和实时PCR。茎环RT引物结合在miRNA分子的3端和用反转录酶逆转录。然后，RT产品使用传统的TaqMan PCR定量，其中包括特定miRNA的正向引物，反向引物和染料标记的TaqMan探针。尾正向引物5的作用是根据miRNA分子的序列组成增加其熔融温度（Tm）。图2。TaqMan-4 miRNA的检测的动态范围和灵敏度。 （A）4超过7个数量级的 lin-4 mi
10、RNA扩增曲线。合成的RNA输入范围从1.3103 fM（相当于每次反应7个拷贝数） 1.3104 FM（相当于每次反应7107拷贝数）；（B）lin-4 miRNA的标准曲线。 miRNA定量的动态范围和灵敏度的计划使用一种人工合成的CEL-LIN-4靶进行首次评估。合成的RNA在 A26值的基础上量化，稀释超过7个数量级。 CEL-LIN-4 TaqMan miRNA的检测结果显示在目标输入和CT值之间有极好的线性关系，表明，该检测有至少7个动态范围，并能够检测PCR反应中少于7个的拷贝数（图2）。 采用小鼠肺总RNA的八个额外miRNA的检测也被证实。RNA的输入范围从0.025到250
11、纳克（图3）。 相关的RNA输入的TheCT 值超过4个数量级（R20.994）。阴性对照检测中，即使在250纳克总RNA鼠标的反应中，CEL-MIR-2没有给出一个检测信号。 根据七个不同的鼠组织中五个miRNA的表达谱测定，创建一个miRNA的表达图谱。每个细胞中的拷贝数根据输入的总RNA（假设15皮克/细胞）和合成lin-4目标的标准曲线计算。从这个表达图谱上作了一些有趣的观察。首先，miRNA非常丰富，组织中每个细胞平均有2390个拷贝数。每个细胞表达的拷贝数在10-32090之间变化。在所有组织中，12个miRNA里，miR-16和miR-323是最丰富和最低量表达的miRNA。此外
12、，每个组织都有独特的miRNA的表达水平。miRNA表达的整体水平在小鼠肺中最高和胚胎中最低。最后，在7个组织中，miRNA表达的动态范围变化很大，从不到5倍(let-7a)到超过2000倍(miR-323) （表1）。 评估RNA分离的需要，我们直接在miRNA的检测中增加了细胞裂解物。相当于直接在7.5毫升逆转录反应中添加2.5-2500细胞。当检测到，在一些细胞中CT值相关R20.998）的RT反应至少有三个数量级（图4）。 图3。总RNA输入的阈值循环（CT）值检测8个miRNA的相关性。每RT反应中，小鼠肺总RNA输入范围从0.025到250纳克。将新杆状线虫的miRNA（MIR-2
13、）列入作为阴性对照。 鼠或人的脑，心，肝，肺，胸腺，卵巢和胚胎（10-12天）的总RNA样品均购自Ambion公司。根据标准曲线lin-4合成的miRNA对每个细胞拷贝数进行估计。每个RT反应中添加150ng的RNA（或相当于约10 000个细胞，假设每个细胞中有15pg总RNA）。依据TaqMan磷酸甘油醛脱氢酶的内对照（P / N4352339E）将RNA规范化输入。 检测了12组非特定的基因组DNA对TaqMan miRNA的影响。结果表明，RT反应中是否添加5纳克人类基因组DNA对CT值没有影响，表明RNA的目标（数据未显示）检测是非常特异的。基于这一观察，我们直接miRNA定量检测中
14、增加了热处理细胞。图5显示了使用纯化总RNA，细胞裂解物，从同样数目的HepG2细胞得到的热处理细胞的miRNA进行定量比较。直接添加热处理细胞的miRNA的检测CT值最低，和其他三种不同的样品制备方法相似。 图4。使用OP9细胞裂解物检测TaqMan miRNA的动态范围。 每个RT体系中输入细胞数范围为3至2500个细胞。采用新杆状线虫elegans miRNA（MIR-2）作为阴性对照。 图5。对热处理细胞，细胞裂解液和10 miRNA实时定量总RNA进行比较。用阈值循环（CT）来衡量miRNA的表达水平。每PCR扩增约400 HepG2细胞进行了分析。 图6。的TaqMan miRNA
15、miR-16的分析比较来解决以印迹杂交为基础的分析。总RNA来自小鼠肾，肝，肺，脾和睾丸组织。 由两个独立运行系统（数据未显示）对12 miRNA16重复检测TaqMan miRNA的可再现性。CT的标准偏差平均为0.1，显示检测的高精度。 我们采用一个独立的技术，这个技术是基于杂交印迹的miRNA分析，比较TaqMan miRNA的检测（图6）。我们观察到杂交为基础的miRNA分析重复性差，在从目标到目标的变化中和TaqMan分析一致。五个鼠组织样本中的miR-16的两种方法（R2= 0.916）一致。然而，在低丰度的miRNA中相关性相对较低，如miR-30的（R2= 0.751）。 杂交
16、的方法对成熟的miRNA来讲缺乏特异性。我们调查了TaqMan miRNA区分成熟miRNA和较长的前体的检测能力，合成pri-miRNA前体，pri-miR-26b和pri-let-7a和pre-miRNA 前体pre-miR-30a（见表2）。 TaqMan分析旨在检测前体和成熟的miRNA进行合成平均1.5的目标108RT反应副本（每PCR体系1.3107拷贝数）。仅PRI-miRNA前体分子的TaqMan miRNA的分析产生了较成熟的miRNA的分析高出至少11个循环的CT值。这一结果意味着，如果成熟的miRNA和前体在浓度相同，后者将在检测成熟的目标时贡献0.05的背景信号。对于pre-miR
