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1、体外培养24小时受精失败卵母细胞单精子显微注射再授精的观察中华妇产科杂志 2000年第7期第35卷 论著作者：李蓉庄广伦周灿权张敏芳单位：李蓉（510080 广州，中山医科大学第一附属医院妇产科）；庄广伦（510080 广州，中山医科大学第一附属医院妇产科）；周灿权（510080 广州，中山医科大学第一附属医院妇产科）；张敏芳（510080 广州，中山医科大学第一附属医院妇产科）关键词： 卵母细胞；受精，体外；胚泡移植【摘要】目的探讨采用单精子显微注射（ICSI）技术处理体外培养24 h后常规体外受精（IVF）失败卵母细胞的效果。方法对1997年6月至1998年10月在我院生殖医学研究中心接受
2、常规IVF治疗的17例非男性因素不育患者，采用常规超排卵方案治疗，经阴道B超介导取卵, 共获卵179个, 体外培养24 h, 所有卵母细胞在常规IVF失败后，采用ICSI再授精。结果共有130个卵母细胞常规IVF失败后进行ICSI再授精， 25个 (19.2%) 卵母细胞在注射过程中受到损伤死亡, 100个存活卵母细胞正常受精, 受精率为76.9%，共移植18个周期，2例临床妊娠。结论如暂不考虑ICSI再授精对胚胎染色体的影响，对于体外培养24 h受精失败的患者，ICSI再授精不失为一个有效的补救方法。Reinsemination by Intracytoplasmic Sperm Injec
3、tion 24-hour after Conventional in vitro Fertilization FailureLI Rong，ZHUANG Guanglun， ZHOU Canquan,et al.（Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Sun Yet-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China）【Abstract】ObjectiveTo examine the efficacy of intracyto
4、plasmic sperm injection (ICSI) for rescue of conventional in vitro fertilization (IVF) failure.MethodsFrom June 1997 to October 1998, 17 women with non-male factor infertility undergoing conventional ovarian hyper-stimulation protocol and IVF in our center, with fertilization failure were reinsemina
5、ted by ICSI. ResultsIntracytoplasmic sperm injection of 130 unfertilized mature oocytes resulted in degeneration in 25 oocytes, successful fertilization occurred in 100 (76.9%) of the survival oocytes, and embryo transfer were done in 18 cycles. Two viable pregnancies resulted.ConclusionIf chromosom
6、e abnormalities of embryos arising from reinsemination were ignored, our results suggest that ICSI is a successful means of rescuing conventional IVF failure.【Key words】Oocytes; Fertilization in vitro; Embryo transfer1994年以来, 陆续有采用卵母细胞单精子显微注射（ICSI）技术处理体外培养24 h受精失败的卵母细胞, 并取得妊娠成功的报道1。我中心采用ICSI技术治疗17例体
7、外培养24 h常规体外受精(IVF)失败、非男性因素不育患者，现将结果报告如下。资料和方法一、研究对象为1997年6月至1998年10月，在本中心接受常规IVF治疗的17例非男性因素不育, 常规IVF取卵后24 h受精失败者。不育患者的不育原因包括输卵管阻塞、盆腔粘连、子宫内膜异位症、排卵障碍。女方平均年龄为(33.33.9)岁，男方平均年龄为(35.24.7)岁，不育时间为(6.93.3)年，常规IVF共取卵179个(10个/例), 体外培养24 h后所有卵母细胞均未受精。二、方法1.控制性超排卵：采用本中心常规IVF-胚胎移植（ET）超排卵方案2，注射绒毛膜促性腺激素(hCG)3436 h
8、后经阴道B超介导取卵，取卵日显微镜下观察所有卵丘、卵母细胞复合物形态无异常。2.精液处理：精液处理采用Percoll梯度离心，精子浓度调至约20106个/ml，常规IVF受精在矿物油覆盖的微滴内进行，根据精子的活动度，微滴内精子浓度约为1105个/ml3105个/ml, ICSI再授精采用取卵日处理的精子。3.卵母细胞的处理：常规IVF受精后1618 h， 予以去卵丘处理, 检查原核及第二极体以确认受精与否，179个卵母细胞均未受精, 未受精卵予以清洗以去除附着于透明带的精子， 选择核网期（M期）成熟卵母细胞进行ICSI再授精。4. ICSI显微操作：采用英国RI公司的显微操作系统，配以倒置显
9、微镜，在放大200倍下进行显微操作，操作的要点是精子的制动和确保精子进入卵母细胞胞浆。携带精子的显微注射针进入细胞浆后，回吸部分胞浆表明卵膜穿破，然后将精子及被回吸的部分胞浆一起注入卵母细胞胞浆中3。有18个周期共130个胞浆松散的未受精M期成熟卵母细胞(有第一极体)进行ICSI再授精。5.胚胎移植：显微注射后2024 h后检查受精情况。正常受精的标准为见到两个独立的或有碎片的极体的同时，有两个清晰的原核。继续培养2428 h，选择无核碎片50%的胚胎进行宫腔内移植，无核碎片20%的剩余胚胎予以冷冻保存。部分受精卵此时处于原核阶段，如总胚胎数4个，原核阶段的胚胎也予以宫腔内移植。临床妊娠检查：
10、胚胎移植后2周行尿妊娠试验检查；移植后5周行B超检查，有胎心音为临床妊娠。结果注射后存活卵母细胞为105个（80.8%），另外25个卵母细胞在注射过程中受到损伤死亡。100个卵母细胞正常受精，受精率为76.9%。其余存活卵母细胞不受精或发生多精受精。79个（79.0%）正常受精的胚胎发生卵裂，平均每个周期移植胚胎数为3.3个，冷冻保存胚胎数6.0个，临床妊娠2例。妊娠的2例均为原发不育(输卵管阻塞)，男方精液常规检查均正常。1例(年龄29岁，男方年龄36岁，不育2年)共取卵7个，取卵后24 h常规IVF未受精，6个成熟卵母细胞行ICSI再授精，并发生正常受精及卵裂，因不符合冷冻胚胎的要求，故6
11、个胚胎均于取卵周期移植，2周后尿妊娠试验阳性，5周后B超检查示胎心搏动。另1例(年龄30岁，男方年龄35岁，不育6年)共取卵22个，取卵后24 h常规IVF未受精，M期卵母细胞16个，ICSI再授精后13个卵母细胞正常受精，10个卵裂，取卵周期移植胚胎4个，冷冻保存胚胎6个，取卵周期妊娠失败后移植冷冻胚胎，B超检查示有胎心搏动。讨论一、 ICSI再授精是常规IVF未受精的补救方法非男性因素不育患者常规IVF失败的原因有：（1）取卵日大部分卵母细胞不成熟, 经体外培养后释放第一极体, 但随体外培养时间的延长卵膜和透明带变韧, 导致常规IVF失败。 ICSI技术能较好的解决这部分卵母细胞的受精。（
12、2）精卵结合障碍。其原因之一是精子与卵母细胞透明带结合后不能发生顶体反应4；也有学者认为是体外培养环境使透明带表面结构发生改变，因而影响精子与透明带的结合能力，ICSI技术直接将精子注射到卵母细胞浆内，使这部分卵母细胞受精。（3）卵母细胞与精子的发育不同步。这与卵母细胞不完全成熟有关，从而使精原核的形成落后于卵原核，卵母细胞胞质的不完全成熟也影响了受精卵的进一步卵裂。ICSI技术不能提高这部分卵细胞的受精率。常规IVF未受精率约为10%25%，大部分为不明原因不育。本研究说明采用ICSI技术再授精，可挽救部分由于卵母细胞不成熟或精卵结合障碍所致的常规IVF不受精的不育患者。二、 ICSI再授精
13、的临床意义ICSI再授精仍是一个有争议的方法，尽管受精率和卵裂率都较高，但妊娠率较低。其原因可能为：（1）不成熟卵母细胞体外培养成熟过程中， 细胞核成熟排出第一极体， 但细胞浆未成熟， 尚未合成维持胚胎进一步发育的有关成分。 因此， 即使卵母细胞受精并发育至48细胞期， 仍无法进一步发育， 从而导致妊娠失败。（2）胚胎的发育与子宫内膜的发育不同步。（3）发生染色体退化的卵母细胞虽具有受精和卵裂的潜能，但形成的胚胎不能着床。而且体外培养24 h后，极体位置发生改变，显微注射时有可能损伤纺锤体，导致胚胎染色体异常。基于上述3点，ICSI的临床应用价值有待进一步探讨。但ICSI可作为不育患者选择下一
14、周期受精方法的参考，对研究受精过程也有一定的参考价值。参考文献1，Lundin K, Sjogren A, Hamberger L, et al. Reinsemination of one-day-old oocytes by use of intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril，1996，66:118-121.2，庄广伦，周灿权，张绣俊，等.体外受精-胚胎移植34例报告.生殖医学杂志，1992，1：24-26.3，李蓉，庄广伦，张敏芳.卵母细胞单精子显微注射治疗男性不育及不明原因不育.中华妇产科杂志，1997，32：211-213.4，Liu DY, Baker HW. Disorder acrosome reaction of spermatozoa bound to the zona pellucida: a newly discovered sperm defect causing infertility with reduced sperm-zona pellucida penetration and reduced fertilization in vitro. Hum Reprod，1994，9:1694-1670.
