《实验 动物细胞培养基础实验技术.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验 动物细胞培养基础实验技术.doc（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验 动物细胞培养基础实验技术器械的清洗与消毒实验目的：学习并掌握细胞培养使用的器皿、器械的洗涤和消毒。实验用品：1仪器和用品：超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器、紫外灯、0.22m/0.45m微孔滤膜。2试剂：75%酒精、5%HCl、1新洁尔灭、重铬酸钾。实验内容：1准备培养用血清瓶（PBS、培养基，约10套，包括20、50ml）、培养瓶（50个）、玻璃滴管（若干）、离心管（10ml）、EP管若干、不锈钢滤器、胶塞、滴头等。2分别包装上述物品，其中血清瓶和瓶盖分别包装，玻璃吸管置于不锈钢筒中、玻璃离心管、 EP管分别置于饭盒中。3将上述物品置于高压灭菌锅中进行消毒灭菌。4实验室准备。实验步骤
2、（一）清洗1玻璃器皿的清洗浸泡 刷洗 浸酸 冲洗（1）. 新购玻璃血清瓶先用洗衣粉洗，再以0.1-0.05 mol/l HCl 浸泡数小时，然后用铬酸浸泡过夜，最后用自来水、一次与二次去离子水洗净后才能开始使用。 （2）. 用过之玻璃血清瓶，用洗衣粉洗净后铬酸浸泡过夜，最后用自来水、用一次与二次去离子水冲洗干净。此外，玻璃器皿的瓶子的盖子必须也泡铬酸，培养瓶瓶盖可以不用泡铬酸，高温灭菌的时候要拧上瓶盖，留有一定的缝隙，灭菌后盖紧。瓶盖的上面应当用锡箔纸或者牛皮纸包住，用绳子扎紧2塑料器皿的清洗自来水充分浸泡 冲洗 2%NaOH浸泡过夜 蒸馏水漂洗3次 2%-5%盐酸浸泡30min 自来水冲洗
3、晾干 紫外线照射30min3胶塞等橡胶类的清洗自来水冲洗 2%NaOH 煮沸15min 自来水冲洗 蒸馏水煮沸10min 自来水冲洗5次以上2%-5%HCl煮沸15min 晾干 晾干后高压灭菌4金属器械的清洗新购置的器械用过的器械（二）包 装分为局部包装和全包装。为了防止消毒灭菌后再次遭受污染。按照不同类别进行包装。（三）消毒灭菌主要包括物理法和化学法。 物理法：热灭菌、蒸汽灭菌、滤过除菌、紫外线、熏蒸消毒、煮沸消毒。 化学法：应用化学制品进行消毒灭菌。（四）无菌室和操作野消毒无菌室内每周用乳酸蒸气（或过氧乙酸）加紫外线消毒1-2次。实验前，将实验器材放入超净台内，打开超净台紫外灯，同时启动超
4、净台风机，40min后消毒完毕，关闭紫外线灯。这样，超净台内空气被净化，超净台面构成相对无菌的环境。或无菌室：每周用75%酒精擦洗后紫外灭菌。实验 培养基的配制及细胞培养的条件一、培养基的特性细胞生存的环境与条件1温度条件（37 0.5）2 pH条件 （7.2-7.4）3气体条件4水的质量（三蒸）5渗透压6营养条件7无菌条件二、培养基的分类1平衡盐液 2天然培养基（小牛血清、胚胎液）3合成培养基（化学成分清楚）三、RPMI1640培养基的配制1、RPMI1640 10 g2、丙酮酸钠 0.11 g3、Hepes（羟乙基哌碃乙硫磺酸） 5.925 g4、NaHCO3 2 g5、三蒸水 1000
5、mL四、过滤出菌 仪器：不锈钢正压滤器 材料：纤维素微孔虑膜 （0.22 mm 孔径）装好后消毒五、完全培养基的配制RPMI 1640 培养液 85 mL小牛血清 10 mL谷氨酰氨 1 mL抗菌素（青、链霉素） 1万单位 1 mL实验动物细胞连续传代培养（SP2/0细胞）一、实验目的：1、为细胞融合准备SP2/0小鼠骨髓瘤细胞；2、杂交瘤细胞的扩大培养（种腹水），或传代培养。二、实验原理：小鼠骨髓效力细胞株（NSI，SP2/0）和杂交瘤细胞均具有无限生长繁殖的能力，它们都属于半贴壁细胞，不用胰蛋白酶或EDTA消化液，只需轻轻冲洗瓶壁上的细胞便可脱落。因而可以利用这些特性对这类细胞进行连续传代
6、培养，以为实验提供生长旺盛的细胞（对数生长期的细胞）。三、实验材料：SP2/0细胞（或杂交瘤细胞）CO2培养箱、细胞培养瓶（25、50、100毫升）、弯头滴管、消毒用套筒（玻璃或铜质）、吸头、RPMI-1640完全培养基、倒置显微镜、试管架、酒精灯、灭菌高压锅。四、实验步骤：1、复苏的或转瓶的传代细胞，使细胞浓度大约为5104/毫升，置375%CO2培养箱中培养。2、培养48小时后，可见部分细胞贴壁生长，而部分细胞呈漂浮状态，可用滴管吸去漂浮的细胞，加入少量新鲜培养基继续培养24小时以上。3、若细胞生长过密，则需及时冲下并吸出部分细胞，或将吸出的细胞转瓶扩大培养，如果不是这样处理，细胞很易出现
7、衰老、死亡现象，对于杂交瘤来讲，这样更易诱发阳性克隆丢失可能性。4、用于细胞融合的骨髓细胞，必须在生长繁殖的对数期（约105细胞/毫升），而且细胞形态规则要一致（圆而亮，有一定的立体感），机能要活跃，活细胞数在9095%以上。要得到这种细胞，其培养技巧在于，在融合前24小时，将生长良好的细胞全部自瓶壁冲下来，并除去1/2或更多的细胞，加入新鲜培养液令细胞重新贴壁分裂增繁。5、作为长期在体外传代培养的细胞，为减少工作量，可采用810%小牛血清的培养基，这样细胞的繁殖速度亦慢，一般可间隔3天更换一次培养液。6、本试验要求各组将细胞自小瓶转入中瓶再转入较大的培养瓶中生长，并用对数增长期的细胞用于冻存
8、和复苏实验（见实验六）。五、结果观察：1、细胞传代前后的生长状态及速度的观察；2、细胞转瓶后生长情况观察；3、了解生长良好，一般及较差细胞的显微镜下观察；4、传代细胞培养的体会。六、注意事项：1、连续细胞传代培养更应注意无菌操作；2、传代时机对于细胞生长的状况及速度十分重要，尤其要注意不能等细胞出现老化后再传代，那样做一般结果并不如愿；3、传代转瓶时细胞量的取舍主要根据细胞量的多少，生长条件优劣以及个人实践经验而决定；4、用于冻存、融合、传代的细胞都要求是处于对数增长期的细胞，不能勉强 为之。实验 淋巴细胞杂交瘤的制备一、实验目的1、系统了解淋巴细胞杂交瘤实验技术的全部过程；2、学会观察与判别
9、融合细胞的出现，并计算融合率。二、实验原理：小鼠骨髓瘤可以在体外培养液中生存并大量繁殖。经过用某种抗原免疫的小鼠及淋巴细胞能分泌某种抗体，但小鼠的B淋巴细胞在一般培养某中不易存活。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌霜种抗体的B淋巴细胞在融合因子（聚乙二醇，PEG）作用下产生融合，则融合的细胞既具有肿瘤细胞易分裂增殖的特性，又具有B淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，在HAT选择培养基中可以选择得到杂交细胞。这种融合的被称为淋巴细胞杂交瘤的细胞可以在体外培养液中大量繁殖生长，从培养液上清中可以收集到大量某B淋巴细胞产物单克隆抗体。三、实验材料：免疫的BALB/小鼠，SP2/O骨髓瘤细胞株，CO2培养箱超净工作
10、台 倒置显微镜 光学显微镜 恒温水箱计数板、计数器、盖玻片； 离心机 手提式自封消毒锅 弯头滴管吸量管（1.0、0、5.0毫升） 注射器（5毫升，10毫升） 针头（7#）细胞培养瓶 24孔、96孔培养板（天津产或进口） 酒精灯120目钢丝网9cm平皿50ml带盖塑料离心管100毫升三角瓶、青毒素小瓶烧杯（100，500，1000毫升）微滤器1000毫升正压不锈钢滤器微孔滤膜眼科剪、镊脱脂棉、纱布、胶布、卫生卷纸HAT培养基HT培养基无血清培养基15%小牛血清培养基小牛血清乙醇（AR，工业纯）CPBS四、培养基与试剂的配制：1、RPMI-1640培养基的配制；RPMI-1640粉10.4g丙酮酸
11、钠0.11gHepes5.925g三蒸水1000ml磁力搅拦器搅拦3小时，溶解后过滤除菌，在4中保存。2、200mML-谷氨酰胺的配制：L-谷氨酰胺1.461g三蒸水100ml深解后，过滤除菌，分装小瓶，每瓶1ml，在-20保存。4.5%碳酸氢钠（NaHCO3）配制NaHCO35g三蒸水100ml8磅高压灭菌15分钟，在4保存。如分装小瓶，每瓶4.2ml。5、次黄嘌呤及胞腺嘧啶核苷（HT）100倍母液配制：次黄嘌呤（Hypoxanthine，H）68.05mg胞腺嘧啶核苷（Thymidine,T） 19.4mg三蒸水50ml在4550水浴中溶解，过滤除菌，分装小试管中，每管15ml，在-20保
12、存。6、氨基碟呤（A）1.76mg三蒸水90mlIN氢氧化钠0.5ml溶解后，加入IN盐酸0.5ml中和，补充蒸馏水至100ml过滤除菌，分装小试管内，每管15ml，在-20保存。7、无血清RPMI-1640100mlL-谷氨酰胺200nM（0.2）1.0ml抗菌素（青、链霉素各1万单位）1.0ml5%碳酸氢钠4.2ml8、RPMI-1640完全培养基配制RPMI-1640完全培养液100mlL-谷氨酰胺200mM（0.2m）1.0ml青、链霉素（各1万单位/ml）1.0ml5%碳酸钠4.2ml小牛血清（灭活）15ml9、HAT培养基的配制：RPMI-1640完全培养基100ml100倍HT母
13、液1.0ml100倍A母液0.8ml10、HT培养基的配制RPMI-1640完全培养基100ml100倍HT母液1.0ml11、50%（W/V）聚乙二醇（PEG）液的配制PEG10.0g8磅15分钟，或煮沸20分钟灭菌并且融化，冷至50时加入。RPMI-1640无血清培养基10ml混合均匀，分装小试管内，每管0.7ml，在-4中保存。12、0.15MPH7.2枸橼酸钠-PBS配制：NaCI 6.4g KCI0.16g NaHPO4H2O2.32g KH2PO40.16g枸橼酸钠 7.6g 二蒸水1000ml分装在100ml瓶中，每瓶50100ml，8磅15分钟高压灭菌后，在4保存。13、20%
14、二甲基亚矾（DMSO）细胞保存液的配制（按体积计算）：小胎牛血清5份RPMI完全培养基3份二甲基亚矾（DMAO）2份混匀，在4保存，不必过滤除菌或高压清毒二甲亚矾，因它也是有毒的以至于自身是无菌的。14、8-氮鸟嘌呤100倍母液的配制8-氮鸟嘌呤1152mg0.36%NaHCO21.0ml4NNaOH 100ml三蒸水100ml过滤除菌，分装小瓶，每瓶1.0ml，在-40保存。15、0.1%伊文氏兰液配制：伊文氏兰液（Fvengs blue）0.1g0.15MPH7.2枸楷酸钠-PBS100ml混匀，4保存，也可配制成1%溶液，保存，使用前再稀释成0.1%。五、实验步骤：1、取末次免疫后的第3天小鼠脾细胞悬液，将108小鼠脾细胞与1-5107SO2/O小鼠骨髓瘤细胞混合于50毫升刻度离心管中，经1000转/分离心7分钟；2、弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37水中进行水浴（一小烧杯中），准备融合；3、将37水浴中保温的
