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1、OD260:OD280比值的应用当你辛辛苦苦纯化出蛋白，准备下一步的实验时，如果后续实验的反应体系中涉及到DNA或RNA或寡核苷酸，那么你就有必要在实验之前测定一下你的蛋白样品中是否有核酸污染。那么，如何判断蛋白是否被核酸污染呢？用OD260:OD280比值！Warburg和Christian（1942）提出OD260:OD280比值是蛋白制品被核酸所污染程度的很好指标。当蛋白中掺入了核酸之后，OD260：OD280比值变化很明显，尤其是纯的蛋白制品中掺入了一点点核酸后，变化最明显。例如：纯的蛋白样品，其OD260：OD280比值为0.57，而掺入5%的核酸之后，该比值上升到了1.06。但是反
2、过来却是不成立的，即：这个比值不能用来指示核酸被蛋白污染的程度。因为核酸在260nm和280nm处的消光系数比蛋白质高很多，即使有明显的蛋白污染也不会大幅度改变核酸溶液的OD260：OD280比值。例如，纯的核酸的OD260：OD280比值是2.0，当掺入了5%的蛋白质污染之后，OD260：OD280比值变成1.99，掺入20%的蛋白质污染后，也才变成1.96。这就说明这个比值用来指示核酸被蛋白污染的程度是非常不灵敏的。从下面这个表中就可以明显看出来。蛋白质核酸OD260:OD28010000.579551.0690101.3285151.4880201.5975251.6770301.736
3、5351.7860401.8155451.8450501.8745551.8940601.9135651.9330701.9425751.9520801.9615851.9710901.985951.9901002A280(nm)紫外光吸收法测定蛋白浓度原理：蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外280nm波长处有最大吸收峰，其光吸收值与蛋白质浓度成正比，故可以用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质含量。优点：1. 快速；2. 对蛋白质无破坏性。缺点：1. 不是严格的定量方法。因为此法是根据酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）残基的强吸收值来测定的，不同
4、的蛋白质具有不同的消光系数。另外，当蛋白质分子中不含Tyr、Phe或Trp残基时，该方法就不能检出蛋白。（此法用于测粗提总蛋白浓度较为适宜）2. 核酸可引起强烈干扰。灵敏度：0.2 mg/ml 2 mg/ml；比色杯最小测量体积为0.1 ml。注意事项：实验室通常认为用1cm的比色杯所测光吸收值为1.0时，蛋白浓度约为1mg/ml，这是非常不精确的。如果实验所用的缓冲液和水有较高的光吸收值，说明缓冲液中有干扰物质存在。测量方法和计算公式：对于不含核酸污染的蛋白溶液（如果样品光吸收值大于2.0，应将样品稀释至光吸收值小于2.0）：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280 nm波长处的光吸收值，一般
5、来说，1 A280 Unit 1mg/ml(对于浓度位于0.02 mg/ml 3 mg/ml范围之内的蛋白样品而言如此，对于浓度小于0.1 mg/ml的蛋白样品，可以采用以下的方法估算：蛋白浓度 A205/31）对于存在核酸污染的蛋白溶液：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280 nm和260 nm波长处的光吸收值，或280 nm和205 nm波长处光吸收值，按照以下公式计算：蛋白浓度（mg/ml）= 1.55 A280 0.76 A260蛋白浓度（mg/ml）= A205 (27 A280/A205)_A260(nm)光吸收测DNA浓度利用260nm光吸收测定DNA浓度计算公式:1 A260
6、Unit of dsDNA = 50 g/ml H2O1 A260 Unit of ssDNA = 33 g/ml H2O注意：A260的光吸收值应当落在0.1到1.0之间。因此需根据不同情况按适当比例稀释。A260/A2801.8代表DNA纯度可以；如果小于1.8，表示有蛋白污染；如果大于2.0则表示可能有RNA污染。A260光吸收值不能体现DNA链的长短。_1 A260 unit of ds DNA =50ug/ml1 A260 unit of ssDNA =33ug/ml纯的DNA A260/A280=1.8如果小于1.8说明污染了蛋白或有机溶剂DNA A260/A2802说明有RNA污
7、染，OD对于DNA的长度无关罗氏手册-紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。试剂与仪器：提取的质粒DNA，紫外分光光度仪。操作步骤：1) 分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。2) 取质粒DNA样品2l，用水稀释100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。3) 在260nm和280nm分别读出样品光密度值。如果样品浓度单位为g/l，则样品DNA浓度为OD 值的10倍，即如 OD260=0.1，则样品浓度即为1g/l。4) 若OD260/OD280大于1.8，说明仍有RNA，可以考虑用RNA酶处理样品，若小于1.8，说明样品中含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA。
