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1、暑期实验生化部分一 实验目的1了解基本的分离提纯蛋白质的原理方法和技术。2提取分子和微生物实验中自制重组细菌产生的蛋白质HSP16.3。3测定HSP16.3的分子活性，了解其分子伴侣活性及寡聚结构。4提纯和检测Tag酶蛋白。二 背景介绍1HSP16.3HSP16.3是来自结核杆菌M.tuberculosis的小分子量热休克蛋白(430bp)。HSP16.3在正常条件下仅有少量表达，当M.tuberculosis从对数期到稳定期的转变中显著表达，并成为细胞内的主要蛋白。另外，HSP16.3还是M.tuberculosis很强的抗原性蛋白，是T，B细胞发生免疫反应的重要靶点。体外实验表明，HSP1
2、6.3具有分子伴侣的活性，HSP16.3在39.5时可以抑制柠檬酸合成酶的热聚集，且其活性不依赖于ATP，但不能保护柠檬酸合成酶的活性，说明HSP16.3是与部分去折叠的柠檬酸合成酶发生作用，体内蛋白的再折叠可能还需要其它蛋白参与。通过凝胶层析还可分离出HSP16.3与柠檬酸合成酶形成的复合物，并在随后的SDS-PAGE中得到证实。HSP16.3可能是通过暴露疏水表面来行使其分子伴侣活性的。实验表明：HSP16.3在较温和温度和低浓度变性剂诱导下，如极低浓度的盐酸胍（0.05 M），尿素（0.3 M）或30的温度处理时，会暴露疏水表面使得其分子伴侣活力迅速上升。HSP16.3是144个氨基酸组
3、成的，分子量为16277Da ，其序列分析结果表明它属于a-crystalline相关的小分子量热休克蛋白（sHSP）家族的一员，具有a-crystalline蛋白家族典型的C末端保守序列：D/N-G-V-L-T-T/V-X-V/A。小分子量热休克蛋白（small heat shock protein, sHSP）家族的蛋白具有多种不同的生物学功能，但都具有分子伴侣的活性，能与变性的蛋白质底物作用并不依赖于ATP参与。这一类蛋白的结构研究表明它们往往通过形成特定的寡聚结构来发挥功能，如M.Janneschii HSP16.5形成二十四聚体，小麦HSP16.9形成十二聚体。HSP16.3是迄今为
4、止发现的几种原核生物的sHSP之一，目前，对sHSP功能，作用机制了解还很少。2Tag酶三 实验原理1、超声波处理法破碎细菌借助超声波的震动力破碎细胞壁和细胞器。处理的效果与样品浓度和使用频率有关。破碎微生物细菌和酵母菌时时间要稍长，使用时应注意降温防止过热。2、 Ni-NTA亲和层析（Ni-NTA Affinity Chromatography） （1）金属螯合亲和层析 金属螯合亲和层析介质上偶联的配基亚氨基二乙酸钠（IDA），在偏碱的环境中容易于二价金属离子如Zn2，Cu2，Ni2发生可逆螯合吸附，二价金属离子又与流动相中的半胱氨酸、组氨酸、咪唑等物质发生可逆性的螯合吸附。金属离子在螯合介
5、质与分离分子间起着桥梁的作用，金属离子一端与螯合介质连接，另一端与被分离组分结合。这两种结合方式都是可逆的，可以根据需要从不同结合部分解析下来。例如，以EDTA为洗脱剂可以从金属离子与螯合介质的结合部位洗脱下来，以咪唑为洗脱剂可以从金属离子与被分离分子的结合部位洗脱下来，利用这一特性可以分离不同用途的蛋白质。 （2）NiIDA和NiNTA IDA只有三个金属螯合位点，与金属离子结合并不紧密，由此导致最后纯化产物不纯等问题。而NiNTA中，NTA是一个四配位基的螯合剂，可以与镍离子六个配位基中的四个螯合，镍离子剩下的两个配位基则与目标蛋白六个组氨酸残基（6x His tag）结合，在较高强度的洗
6、脱条件下，仍保持良好的结合力。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子产生结合作用，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。图1 不同的配基与镍离子的螯合 （左）Ni氨三乙酸配合物，NTA与镍离子中四个配位基结合，结合更紧密； （右）Ni亚氨二乙酸配合物，IDA与镍离子的三个配位基结合。3、紫外吸收法测蛋白质含量蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行
7、蛋白质含量的测定。4. 透析（Dialysis）经由半透膜的两端及透析液中的分子，经浓度的差异而互柤产生自由扩散(Diffusion)的现象叫作透析作用。 通常将半透膜制成袋状，将生物大分子溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。透析技术可用于除盐、除生物小分子杂质和浓缩样品。透析的动力是扩散压，扩散压由跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度正比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4透析，升高温度可加快透析速度。5、SDSpa
8、geSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。SDS即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂b-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液后，要在沸水浴中煮35 min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。SDS与蛋白质结合后使蛋白质SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身
9、的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以用于未知蛋白分子量的测定，在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各个的标准蛋白的电泳距离（或迁移率），并对各自分子量的对数（log Mr）作图，即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离（或迁移率），通过标准曲线就可以求出未知蛋白的分子量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条
10、带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。6 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native Gel） 天然聚丙烯酰胺电泳，是指未加SDS，也未经强还原剂如DDT和巯基乙醇处理的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳。目的是为了使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷。利用蛋白质分子中带有净电荷的数目差异，以及分子质量、形状不同，在电场中泳动的速度和方向有区别，从而达到分离的目的。在电泳分离后仍能保持
11、蛋白质和酶等生物大分子的生物活性。 与其他方法相比，Native Gel电泳分辨率较低，使用合适浓度和孔径的凝胶、有足够长度的凝胶、小体积加样等方法，可提高分辨率。四、材料、仪器与步骤1. 细胞收集和破碎 材料：经诱导表达目的蛋白（HSP16.3）的大肠杆菌 设备：大型低温离心机，高速低温离心机，细胞超声破碎仪，4/-20冰箱 试剂：Buffer A（25mmol/L TrisHCl,，0.15mol/L NaCl，pH 8.0） 实验步骤：（1） 将150ml菌液(经诱导表达目的蛋白的大肠杆菌)转入大离心瓶中（2tubes/组），离心收菌，5000rpm，10min, 4oC（留沉淀）；（2
12、） 配制Buffer A缓冲液：配制时先分别加入4.31gTris.HCl和1.51gNaCl，用去离子水定容至500ml，HCl调pH值至8.0，配制成终浓度为25mmol/L TrisHCl,，0.15mol/L NaCl，pH 8.0的溶液。（3） 倒掉上清，将离心管中的菌体沉淀悬于40 ml Buffer A缓冲液（pET系统用Buffer A，25mmol/L TrisHCl, 150mmol/L NaCl，pH 8.0），再移至小烧杯中；（4） 超声破碎细菌(冰浴) ：工作功率 400KW, 工作5秒, 停止5秒, 每次50个循环, 共3次，每次间歇12min；超声注意事项：* 盛
13、装菌液的小烧杯要放在冰盒底部，防止超声过程中冰融后烧杯移位；* 探头要距离烧杯底部有一定距离，大约5mm，但又不能离底部过远；* 探头一定要插入液体内方能开机，严紧空载开机；工作时钻头要在液面中间，保证超声效果；* 超声过程中冰会融化，应及时添加冰。* 所用超声机适合破碎30ml以上的溶液；* 基本参数都已设定，不要随便修改已设定好的参数，开机后只需调整功率输出旋钮，把输出功率调整到200W左右；一般情况下工作功率设定在200W左右即可，但由于本作超声机钻头较细，加大功率至300W；* 在使用中出现的问题应及时通知老师；* 超声破碎后，要用去离子水再超声五次，擦干探头，防止残留菌液结垢。（4）
14、 将破菌产物离心，12000rpm，30min, 4oC；（5） 留上清，沉淀溶于30ul的buffer A中，4冰箱保存，分别对上清和沉淀留样，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳, 鉴定表达情况和蛋白可溶情况。2. NiNTA亲和层析蛋白 材料：高速离心得到的蛋白上清，Ni-NTA介质设备：制冰机，4/-20冰箱，亲和层析柱，电磁搅拌器，紫外分光光度计 试剂： Buffer A(25mmol/L TrisHCl,，0.15mol/L NaCl，pH 8.0) 1mol/L咪唑溶液50mmol/L NiSO4洗脱液1（20mM咪唑）： 在20ml的buffer A中加入400l 1mol/L咪唑，
15、配成终浓度为25mmol/L Tris.HCl，150mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH8.0的溶液； 洗脱液2（200mM咪唑）： 在16ml的buffer A中加入4ml 1mol/L咪唑， 配成终浓度为25mmol/L Tris.HCl，150mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH8.0的溶液。实验步骤： （1） 处理介质：向柱中加入1ml NTA介质后，按下列顺序清洗和处理层析柱： 去离子水（3柱体积，约20ml） Buffer A（10ml）平衡介质。（2） 加入蛋白样品： 加入40ml超声破菌后的蛋白上清样品（保留穿过液），手动加液，最后保留30l穿过液样品用作SDSPAGE检测。 （3） 洗脱杂蛋白： 用10ml buffer A洗脱介质。 将柱用buffer A装满后放入4冰箱过夜。（4） 洗脱目标蛋白：用20ml洗脱液1（20mM咪唑）洗脱介质，保留30l穿过液样品用作SDSPAGE检测；用20ml洗脱液4（200mM咪唑）洗脱介质，手动收集，每管1ml。以buffer A为参比，测量上述三次洗脱收集的洗脱液的OD280。（5） NTANi2琼脂糖再生： 10ml 1M咪唑 20ml去离子水 10ml 50mM NiSO4 10ml 20 乙醇 加入20乙醇，封口，4保存。 3. 透析 材料：固体NaH2PO4，透析袋，OD28
