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1、多功能原生质体融合菌株的构建作者：湖南农业大学来源：湖南农业大学时间：2009-01-07项目负责人：谭周进 完成单位：湖南农业大学项目来源及编号：省教育厅青年项目（05B029）成果简介：一、研究背景 微生物广泛应用于农业、工业、医药、食品及环保等各个领域。迄今其应用多采用纯培养方式,即一种菌单独培养以获取有用物质。人类对微生物的利用经历过天然混合培养到纯种培养两个阶段,纯培养技术使得研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局面,能够不受干扰地对单一目的菌株进行研究,从而丰富了我们对微生物形态结构,生理和遗传特性的认识。但是,在长期的实验和生产实践中，人们不断地发现很多重要生化过程是单株微生物不能完
2、成或只能微弱地进行的，必须依靠两种或多种微生物共同培养完成，在自然界更为常见的是多种微生物混合培养。随着微生物应用技术的广泛开展，微生物培养技术也显得越来越重要。 在活菌制剂的应用方面，人们希望一种产品能够行使多种功能，解决多方面的问题，许多产品都是由多种微生物组成。目前，这类产品的生产形式上，一般采用将单一菌种分开培养，然后将多种菌的培养物混合在一起，组成多菌种多功能产品。这种生产方式，要求每种菌使用一次发酵罐，要求生产设备投资较大，能耗较高，大大提高了生产成本。现代发酵技术已建立了多菌种混合发酵技术，但该技术生产过程也较复杂，难以保证产品中各菌种的数量协调。应用微生物育种技术中的微生物原生
3、质体融合技术，设法将不同功能的菌种通过原生质体融合技术构建多功能单一菌种，能够达到单一菌种多功能的效果，对于降低多功能微生物产品的生产成本,增加效率,在实际应用中很有意义。 二、研究方法与步骤 1菌体培养 斜面上挑取少量KR和B13菌种，分别接种至含50mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250ml三角瓶中，37，150r/min活化12h；取1mL活化后的培养液接种至新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基，KR在37，150r/min条件下培养16h，B13在37，150r/min条件下培养12h。 2两菌株生长曲线的测定 分别将活化12h的两菌株牛肉膏蛋白胨发酵液1mL移至100mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基，
4、摇匀，取12支无菌大试管，每支加入5mL，37，150r/min培养，两小时取样一次，测定A600nm下的吸光度。 3酶解前计数 分别将两菌种发酵液3000r/min离心5min，除去杂质，取上清，摇匀，取1mL用装有9mL无菌水的大试管依次稀释到合适浓度，各吸0.1mL分别涂布于牛肉膏蛋白胨固体平板，37培养24h，计数为A。 4原生质体制备 将离心后除去杂质的KR上清液与pH8.0，1.2mol/L蔗糖的高渗溶液按1：1混合，加入一定量溶菌酶，使溶菌酶浓度为8mg/mL，37，150r/min酶解80min；将离心后除去杂质的B13上清液与pH7.0，0.6mol/LNaCl的高渗溶液按1
5、：1混合，加入一定量溶菌酶，使溶菌酶浓度为6mg/mL，37，150r/min酶解45min。期间用血球计数板在光学显微镜下观察原生质体形成情况，隔20或15分钟取样一次，用无菌水稀释成合适浓度后涂布牛肉膏蛋白胨固体平板计数B。原生质体得率即为：（A-B）/A% 5酶浓度对原生质体制备的影响 分别将酶解体系中溶菌酶的浓度调至2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL，按上述方法制备KR的原生质体，平板计数法计算原生质体得率。 分别将酶解体系中溶菌酶的浓度调至2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL，按上述方法制备B13的原生质体，平板计数法计算原生质体得率。 6酶解
6、时间对原生质体制备的影响 按上述方法制备KR和B13的原生质体。KR分别酶解20min、40min、60min、80min及100min，平板计数法计算KR原生质体得率；B13分别酶解15min、30min、45min、60min，平板计数法计算B13原生质体得率。 7菌龄对原生质体制备的影响 分别取在牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养12h、16h和20h的KR和B13菌体制备原生质体，按上述方法。平板计数法计算KR和B13原生质体得率。 8稳定剂对原生质体制备的影响 分别将离心后的KR和B13发酵液与含0.8mol/L，1.2mol/L，1.6mol/L的NaCl，蔗糖，葡萄糖，D-果糖的磷酸缓
7、冲液1：1混合，按上述方法制备KR和B13的原生质体，平板计数法计算KR和B13原生质体得率。 9pH值对原生质体制备的影响 分别用pH值为5、6、7、8、9的磷酸缓冲液作为反应体系，按上述方法制备KR和B13的原生质体，平板计数法计算KR和B13原生质体得率。 10原生质体制备和再生 分别将两菌种发酵液3000r/min离心5min，取上清，摇匀。将KR上清液与pH8.0，1.2mol/L蔗糖的高渗溶液按11混合，加入溶菌酶，使酶浓度达到8mg/mL，37，150r/min酶解80min；将B13上清液与pH7.0，0.6mol/LNaCl的高渗溶液按11混合，加入溶菌酶，使酶浓度达到6mg
8、/mL，37，150r/min酶解45min。 将原生质体酶解液1500r/min离心10min，去上清，用一定量SMM保存原生质体沉淀，轻轻摇匀，制成原生质体悬浮液。取1mLSMM原生质体悬浮液用水依次稀释到合适浓度后，分别接种至原生质体再生培养基，采用夹层培养方式，为未酶解的细胞B；另取1mLSMM原生质体悬浮液用SMM稳定剂依次稀释到合适浓度后，涂布平板计数，为再生细胞数C。原生质体再生率=（C-B）/A-B%。 11酶解时间对两菌株原生质体再生率的影响 KR分别酶解20、40、60和80min，终止酶解，B13分别酶解15、30、45和60min，按上述方法再生两菌株，计算两菌株原生质
9、体再生率。 12再生方式对两菌株原生质体再生的影响 将KR和B13分别采用不同方式再生。单层培养：含2%琼脂的再生培养基倒平板，加入原生质体悬浮液0.1mL，涂布再生；夹层培养：下层为再生培基，琼脂含量2%，除去冷凝水，取原生质体悬浮液0.1mL加到平板上，然后加含琼脂0.8%的半固态再生培养基5mL左右，迅速摊步均匀；混合培养：培养皿加入原生质体悬浮液0.1mL，加入40含0.8%琼脂的再生培养基，混匀培养按上述方法再生两菌株，计算两菌株原生质体再生率。 13稳定剂对两菌株原生质体再生的影响 分别以0.4mol/LNaCl；0.6mol/LNaCl；0.8mol/LNaCl；0.4mol/L
10、蔗糖；0.6mol/L蔗糖；0.8mol/L蔗糖；0.4mol/L葡萄糖；0.6mol/L葡萄糖；0.8mol/L葡萄糖；0.4mol/LD-果糖；0.6mol/LD-果糖；0.8mol/LD-果糖作为KR和B13再生培养基中的稳定剂，按上述方法再生两菌株，计算原生质体再生率。 14Ca2+对两菌株原生质体再生的影响 再生培养基中分别添加0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/LCaCl2，按上述方法再生两菌株，计算原生质体再生率。 15Mg2+对两菌株原生质体再生的影响 再生培养基中分别添加0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.0
11、4mol/LMgCl2，按上述方法再生两菌株，计算原生质体再生率。 16L-色氨酸对两菌株原生质体再生的影响 再生培养基中分别添加0mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.03mol/LL-色氨酸，按上述方法再生两菌株，计算原生质体再生率。 17再生培养基放置时间对两菌株原生质体再生的影响 将再生培养基倒人平皿中，在37烘箱中分别放置24h、48h、72h后涂布原生质体悬液再生，按上述方法再生两菌株，计算原生质体再生率。 18融合子筛选及遗传稳定性鉴定 将KR和B13两菌株原生质体SMM悬液按体积比1：1混合，轻轻混匀，3000rmp/m离心10min，去上清，菌体沉淀加入一定量浓
12、度为40%的PEG5000融合液，38水浴静置3min，用装有9mlSMM的大试管稀释到适当浓度，每个含氯霉素和硫酸妥布霉素（为筛选的抗性标记）的筛选平板滴加0.1mL，用涂棒轻轻涂布均匀，采用夹层培养法，37培养48120h，将长出的菌落分离、纯化，挑选单菌落，用牛肉膏蛋白胨斜面保存。每个处理做3次重复，每次涂布20个平皿，计算每种处理融合子总数。并在含有双抗生素的融合子筛选培养基上传代培养以鉴定其稳定性。 19融合子的特性研究 通过细菌形态学与生理生化方法研究融合子的细菌学特征,并且利用平板对峙法研究研究融合子的抑菌功能。 三、研究的主要内容与结论 本课题选育了对白菜软腐菌有较好抑制效果的
13、芽孢杆菌KR和对白菜黑斑病菌有较好抑制效果的假单胞菌B13，然后以此二菌为出发菌株，对二者的原生质体制备、融合、再生和筛选进行了研究，构建了融合子KB1，并对其进行了形态结构、生理生化以及对白菜软腐菌和白菜黑斑病菌的抑制作用研究，其主要结果如下： 1、选育了对白菜软腐菌有较好抑制效果的芽孢杆菌KR和对白菜黑斑病菌有较好抑制效果的假单胞菌B13，并且对其相关特性与效果进行了研究，培养硕士生1名（贺小香，大白菜软腐病菌的拮抗内生细菌的筛选及其拮抗作用的研究，2006年）； 2、进行了芽孢杆菌KR和假单胞菌B13原生质体制备酶解时间与浓度、稳定剂、菌龄、pH值等因素对革兰氏阳性菌株芽胞杆菌KR和革兰
14、氏阴性菌株假单胞菌B13的原生质体制备影响的研究，结果表明：在以0.6mol/L蔗糖为稳定剂，pH8.0，溶菌酶浓度8mg/ml，37，酶解80min的条件下，芽胞杆菌KR原生质体得率为31.6%；在以.0.6mol/LNaCl为稳定剂，pH7.0，溶菌酶浓度6mg/ml，37，酶解45min假单胞菌B13原生质体得率最高，为95.2%； 3、对影响革兰氏阳性菌株芽胞杆菌KR和革兰氏阴性菌株假单胞菌B13的原生质体再生的因素进行了研究，结果表明：对KR酶解20min，采用夹层培养，再生培养基中加入0.6mol/L蔗糖，0.03mol/LCa2+，0.02mol/LMg2+，0.3mol/L琥珀酸钠，0.2g/LL-色氨酸，培养基在37下放置72h，原生质体再生率可达42.7%；对B13酶解15min，采用夹层培养，培养基中加入0.6mol/LNaCl，0.02mol/LCa2+，0.01mol/LMg2+，0.3mol/L琥珀酸钠，0.1g/LL-色氨酸，培养基在37下放置48h，原生质体再生率可达15.3%； 4、对芽孢杆菌KR和假单胞菌B13的融合及融合子筛选进行了研究，结果表明：2.0单位/mL的硫酸妥布霉素和510-3g/mL的氯霉素可分别抑制B13和KR，培养基中添加这两种抗生素可选出融合子。通过PEG法制备KR和B13原
