《免疫银光技术.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《免疫银光技术.doc（55页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 免疫荧光组织化学技术一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述二、免疫荧光组织化学的原理（一）直接方法1 检查抗原方法2 检查抗体方法（二）间接方法1检查抗体(夹心法)方法2检查抗体方法 3检查抗原法 （三）补体法1直接检查组织内免疫复合物方法2间接检查组织内抗原方法（四）双重免疫荧光组织化学标记方法（五）对照实验1 直接方法 2 间接方法 3 补体方法 三、荧光抗体的制备（一）荧光素 1 异硫氰酸荧光素 2 四甲基异硫氰酸罗达明 3 得克萨斯红(Texas red)4其它荧光素（二）荧光素标记抗体的方法 1FITC标记抗体的方法2四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法3藻红蛋白标记抗体方法4蓝色荧光素
2、标记抗体方法（三）荧光抗体的质量控制 1染色特异性和敏感性的测定方法2F/P比值的测定方法3荧光抗体的保存四、免疫荧光组织化学染色方法（一）荧光抗体染色方法1直接方法2间接方法(双层法) 3间接方法 (夹心法) 4补体方法5膜抗原荧光抗体染色方法6双重染色方法7荧光抗体再染色方法（二）荧光抗原染色方法五、荧光显微镜检查方法（一）荧光和荧光显微镜（二）荧光显微镜标本制作规定1载玻片2盖玻片3标本4封裱剂5镜油（三）使用荧光显微镜注意事项（四）荧光图像的记录方法六、非特异性染色的消除方法（一）非特异性染色的重要因素（二）消除非特异性染色的方法1葡聚糖凝胶G-50柱层析法2DEAE纤维素柱层析法3荧
3、光抗体稀释法4纯化抗原方法5纯化抗体方法免疫吸取方法6伊文氏蓝(Evans blue)衬染色方法七、现状与展望 免疫荧光组织化学技术一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述免疫荧光组织化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons和他的同事(1941)建立，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞(或组织)化学。它与葡萄球菌A蛋白(SPA)、生物素与卵白素、植物血凝素(ConA等)相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机，扫描电视和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光组织化学技术；荧光激活细胞分类器Fluorescin activated cell sorter (FACS
4、)的应用，激光共聚焦显微镜的问世，使免疫荧光细胞技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。细胞显微分光光度计与图像分析仪的结合使免疫荧光组织化学的定量检测更加准确。80年代到90年代相继又有新的荧光素出现如R-藻红朊，B-藻红朊，C-藻青蛋白，cy2, cy3, cy5, cy7均在流式细胞仪和激光共聚焦显微镜中广泛应用。由于免疫荧光组织化学的特异性，快速性和在细胞水平定位的准确性，已在免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学以及临床检查等许多方面得到广泛应用，日益发挥重要的作用。二、免疫荧光组织化学的原理免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反映的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光
5、抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上具有标记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到本来的低能态，这时发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，运用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而拟定抗原或抗体的性质和定位，以及运用定量技术测定含量（图3-2-1）。图3-2-1紫外光激发荧光物质放射荧光示意图用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法。用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。免疫荧光组织化学分直接法、间接法和补体法。（一）直接方法1
6、检查抗原方法这是最简便、快速的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体，直接用于细胞或组织抗原的检查。此法特异性强，常用于肾穿刺，皮肤活检和病原体检查，其缺陷是一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。（图3-2-2）图3-2-2 直接法2 检查抗体方法将抗原标记上荧光素，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反映，而将抗体在原位检测出来。（二）间接方法1检查抗体(夹心法)方法 此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反映，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。2检查抗体方法 用已知抗原细胞或组织切片，加上待检血清，假如
7、血清具有切片中某种抗原的抗体，抗体结合在抗原上，再用间接荧光抗体(抗种属特异性IgG荧光抗体)与结合在抗原上的抗体反映，在荧光显微镜下可见抗原抗体反映部位呈现明亮的特异性荧光。此法是检查血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。3检查抗原法此法是直接法的重要改善，先用特异性抗体与细胞标本反映，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体与结合在抗原上的抗体结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。同直接法相比荧光亮度可增强3或4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以合用于同一种属产生的多种第一抗体的标记显示，这是现在最广泛应用的技术。（三）补体法1直接检查组织内免
8、疫复合物方法 用抗补体C3荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反映，而形成抗原-抗体-补体抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物上补体存在处，此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。2间接检查组织内抗原方法 常将新鲜补体与第一抗体混协议时加在抗原标本切片上，经37孵育后，如发生抗原抗体反映，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反映，形成抗原-抗体-补体荧光抗体的复合物，此法优点是只需一种荧光抗体可合用于各种不同种属来源的第一抗体的检查。（四）双重免疫荧光组织化学标记方法在同一组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色，一般
9、均采用直接法，将两种荧光抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TMRITC或RB200标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。（五）对照实验 为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次实验时进行以下对照实验：1直接方法 （1）标本自发荧光对照：标本只加PBS或缓冲甘油封片，荧光显微镜观测组织内假如有荧光，称为自发荧光。 （2）克制实验：可分为二步方法和一步方法。1）一步克制方法：先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性。2）二
10、步克制方法：标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。（3）阳性对照：用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织化学染色，结果应呈阳性荧光。结果：如对照1和2无荧光或弱荧光，3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。2间接方法（1）自发荧光对照：同直接法。（2）荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。（3）克制实验：同直接法。（4）阳性对照：同直接法。结果：如对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本呈阳性荧光则为特异性荧光。3补体方法（1）自发荧光对照（2）荧光抗体对照（3）克制实验（4）补体对照：取新鲜豚鼠血清1:10稀释先作用标本，洗后再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。（5）克制实验：标本加灭活的第一
