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1、多功能性酶催化直接不对称aldol反应研究 独创性声明学位论文题目:垒功能:眭酶董丝直接丕怼盗垒鱼厦虞的婴究本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果了敬中弓佣他人已经发表或出版过的研究成果文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。, 日签字日期:矽年步月学位论文作者:磊侈桫学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院筹可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以
2、采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后适用本授权书,本论文:口不保密,年口保密期限至 月止.导师签名: 导师签名:。学位论文作者签名:菇易砺 懂挡傲硝学位论文作者签名:刃勿砺签字日期: 年歹月毽日 签字日期:矽年纩月日伽.:、目 录 摘 要?.第章绪论.酶催化多功能性概述?.酶催化多功能性的分类.修饰后的酶催化多功能性?.多功能性酶催化的各种反应?.酶催化多功能性研究的重要意义?.总结与展望?.第章核酸酶催化直接不对称反应的研究.前言?.实验部分.结果与讨论.结论?.第章地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶催化直接不对称反应的研究.前言?.实验部分.结果与讨论.结论?.第章
3、木瓜凝乳蛋白酶催化直接不对称反应的研究.前言?.实验部分.结果与讨论?.结沧?.参考文献代表化合物图谱硕士阶段发表文章?.致谢?.摘要曼曼皇曼曼曼曼皇曼舅曼曼曼量曼量皇曼鲁曼曼曼舅曼曼曼舅曼曼曼曼舅舅曼曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼舅量曼舅舅舅曼量曼曼皇曼曼曼皇曼量鼍曼舅多功能性酶催化直接不对称反应的研究有机化学专业硕士研究生 李海虹指导教师 官智教授摘 要生物催化由于具有立体选择性高、反应条件温和,反应速度快等优点备受人们关注。酶催化合成方法的研究是目前非常活跃的前沿领域。酶是可再生资源,来自各种动植物的酶,通过现代生物技术在微生物中高度表达,可以实现大规模生产。然而自然界中酶的种类是有限的,而且酶具
4、有专一性,一种酶有特定的天然底物,因此研究生物酶除天然属性以外的其他催化特性显的特别重要。近年来,在酶催化多功能性方面的研究新成果不断涌现,一些蛋白酶和脂肪酶被发现能够催化加成反应,反应以及等经典反应。这极大的拓展了酶催化的应用范围。研究酶的新功能为绿色化学的发展提供了新的有效途径,是一个极具吸引力和挑战性的课题。反应是有机合成中构建新碳碳键的重要反应类型之一,但是除了在生物体内催化反应的醛羧酶以外,已知的能够催化反应的酶很少有人报道,因此研究多功能性酶催化的反应具有重要的意义。本论文首次发现核酸酶,地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶对反应有很好的催化功能。主要研究这三种酶对芳香醛和环状酮
5、之间直接不对称反应的催化作用,为了进一步弄清酶的催化效果以及催化机理,我们分别对三种酶做了空白对照,失活、活性位点抑制实验,并对机理问题进行了研究。在研究这三种酶对直接不对称反应的催化效果时,我们分别对这三种酶的反应条件进行了优化,例如溶剂,含水量、投料比、酶量,温度,值等。实验结果表明不同的酶催化反应的最佳溶剂不同,一种酶在不同溶剂中催化同一种反应所需要的最佳含水量也不相同。一般情况下这三种酶在与水混溶的二甲亚砜溶剂中催化反应有较高的产率,但是立体选择性相对较差;木瓜凝乳蛋白酶在乙腈溶剂中产率低,但是立体选择性较好。核酸酶在无溶剂的条件下催化的反应有较好的立体选择性。在最佳的反应条件下,选择
6、了、种芳香醛和种酮,一共合成了种已知产物,产物经过 .手两南大学硕士学位论文性等手段表征分析和验证。核酸酶 .是由桔青霉培养液中提取冻干而成。它是一类可以将核酸定向水解为,核苷酸的酶制剂,它可以催化或寡核酸分子上的,碳原子羟基与磷酸之间形成的二脂键,使其断裂生成四种,核苷酸和,磷酸寡核苷酸。论文首次发现核酸酶可以催化反应且对反应底物有较广的适用范围,核酸酶催化得到的产物得到了最高大于%的值和%的值。碱性蛋白酶是由地衣芽孢杆菌经深层发酵提取而成。是一种在碱性条件下,可催化水解蛋白质的酶制剂。论文首次发现它也能催化反应,且在二甲亚砜溶剂中得到最高%的产率。木瓜凝乳蛋白酶 .是从天然番木瓜未成熟的果
7、实中分离提纯的半胱氨酸蛋白酶,常用来治疗椎间盘突出,癌症等。论文首次发现它对反应也有特殊的催化多功能性。关键词: 核酸酶碱性蛋白酶木瓜凝乳蛋白酶反应酶催化多功能性量曼量舅曼曼曼曼曼曼曼量曼曼曼曼皇曼曼曼皇皇曼曼量曼曼? ? 曼曼一:,.,., ., ., . . . ., ., , . . 连,. 两南大学硕十学位论文 .,.曲 . .、 . . %.:/:. ?%?%.,位/. .; ;: ;第章绪论第章绪论.酶催化多功能性概述在过去的教科书上一直强调酶的最大特点就是专一性,即每种酶只对专一的底物起催化作用,在这样的背景下人们忽略了酶的其它催化性能,酶的催化专一性成了酶的最大优点同时也是一大
8、缺点【】。自从二十世纪八十年代初期报道了酶不仅可以在无水的有机溶剂里保持活性【,引,而且在有机溶剂中它还具有了新的功能,例如,稳定性提高,反应底物类型和对映体选择性改变,分子记忆功能,催化新反应类型的功能【】。这一发现颠覆了原来的观点,即酶只能在水溶剂中起作用。同时还提出了酶促反应在有机溶剂中进行比在水溶液中进行的几个优点:第一,大多数有机化合物在有机溶剂中溶解性很好;第二,由于在动力学和热力学上的限制,酶在水溶液中是不可能催化其它反应类型的;第三,在有机溶剂中,酶的稳定性增加;第四,产物回收在有机溶剂中比在水相中容易;第五,由于酶在有机溶剂中不溶解,使得酶比较容易回收和重新利用,减去了固定化
9、的麻烦。这一观点掀起了研究有机溶剂中酶促反应的热潮,在过去的几年里越来越多的酶被发现不仅能够催化其天然反应,在有机溶剂中其活性部位还可以催化一种或者多种其他的反应类型,这些具有催化多功能性的酶为有机合成提供了诸多新型催化剂【卜。年,瑞典的和研究小组报道用活性位点定点突变的脂肪酶催化,.二羰基化合物和,.不饱和羰基化合物之间的;成反应,并首次把这种天然的酶催化非天然底物参加新的反应称作酶的多功能性【引。年,浙江大学林贤福研究小组报道了水解酶以及酰基转移酶在有机溶剂中催化,.二羰基化合物和仅,.不饱和羰基化合物之间的力成反应】。年,奥地利研究小组报道了脂肪酶催化的类型的.健形成反应【】。然而,以上
10、这些多功能性酶催化的力:成反应都没有立体选择性。 年,我们研究小组报道了固定化脂肪酶力成反应【。以上催化的不对称.这些酶催化的反应都是利用酶的多功能性催化新的反应类型。由于目前自然界中酶的数量是有限的,因此人们越来越关注挖掘自然界中现存的酶的新的催化功能。不对称反应是有机合成中构建.键的重要方法之一,在有机合成中有很多关于有机小分子催化不对称反应的报道,并得到很好的产率和对映体选择性【。然而发现新型的催化不对称反应的有效催化剂仍然具有很大的挑战性【。众所周知,在生命细胞中每时每刻都有反应被醛羧酶催化,目前有一两南大学硕士学位论文些报道醛羧酶催化反应的精彩例子【。然而,除了醛羧酶以外其他酶催化的
11、反应报道比较少,因此我们认为研究多功能性酶催化直接不对称反应具有重要的意义,本课题主要就是研究用自然界中已有的酶催化其非天然底物进行反应。.酶催化多功能性的分类和首先对酶的多功能性 的类型进行了如下定义和分类:第一种类型是酶的催化环境多样性。主要是指酶在多种不同于天然反应条件的反应环境下表现出来的催化活性,例如无水的反应介质,很极端的温度或值等条件。第二种类型是酶的反应底物多样性。主要是指酶对除天然底物以外的其他底物具有催化活性。第三种类型是酶的催化多样性。主要是指酶催化不同的反应类型,经历不同的转换状态,酶催化多样性还可以细分为以下两种类型:非本质属性。主要是指天然的酶具有催化一种非天然反应
12、的能力;诱导产生的属性。主要是指一种天然酶的一个部位或者多个部位被诱导突变后可以催化一些新的反应类型【掩。在本文中,我们主要探究第三种类型酶催化多功能性,即一种天然的酶或者是某些部位经过定点突变后的修饰酶催化新的反应类型,其中天然酶催化非天然类型的反应为本论文研究和讨论的重点。.修饰后的酶催化多功能性生物催化无论是在实验室规模还是在产业化规模,在化学转化方面都表现出可再生性能【】。虽然自然界提供了大量的有此能力的催化剂,天然的酶可能有些难以提纯获得或者是可以获得的酶对我们感兴趣的反应不起催化作用。因此,修饰现存酶的某些部位使它的催化活性改变,甚至是获得全新的催化活性引起了人们的关注【,。由于醛
13、羧酶对.键形成和断裂的对映体选择性很强,在实际应用中尤其受到人们的青睐。天然的醛羧酶已被大规模用来催化广泛的反应。另外,酶工程技术已经广泛应用于生产新的具有更高活性和更广泛底物的生物催化剂以满足化学和制药工业对分子多样性的需要【“们。研究小组将吡哆醛磷酸盐依赖的丙氨酸消旋酶 .的第位酪氨酸换成丙氨酸就使一个消旋酶变成了一个醛羧酶【。丙氨酸消旋酶的活性部位模型如图.。并且这个突变的酶可以催化反应。像这种酶活性部位的一个氨基酸被别的氨基酸取代而具有了新的催化能力的现象是酶的可再生性的重要表现。研究小组用活性位点突变的丝氨酸水解酶第章绪论.催化反应,并将天然的脂肪酶和经过修饰的,脂肪酶以及牛血清催化
14、反应的活性进行了比较【。图.丙氨酸消旋酶的活性部位模型。天然的丙氨酸消旋酶活性部位模型,丙氨酸消旋酶活性部位的位的酪氨酸被丙氨酸取代移除了消旋酶活性所必须的催化残基,同时也创造了一个新的空穴来容纳.构型的一苯基丝氨酸异构体。. . 酶工程的发展使酶的利用价值大大提高,酶的某些部位经过定点突变,或者几个部位用不同的氨基酸替代都会使酶具有新的性质。关于修饰酶的多功能性研究近几年报道逐渐增多,这些经过酶工程修饰后的酶将成为有应用价值的新型催.化剂,为化学合成提供了新的方法和途径。?.多功能性酶催化的各种反应由于水解酶比较容易得到,且使用范围比较广,因此对水解酶催化的多功能性研究相对较多。近年来,越来越多的酶被发现具有催化非天然底物参加新反应类型的能力。其中关于多功能性酶催化的反应,成反应,加成反应,反应以及反应等都有了新的进展,下面我们将详细介绍多功能性酶催化的此类反应。.多功能性酶催化的反应 :反应是构建.键的重要方法之一,在有机合成中占有重要的地位。年,和同事首次报道了脱氧核糖.磷酸醛缩酶叫催化的一锅化反应【,。年首次发现经过生物工程定点突变的脂肪酶. 具有了催化反应的新功能,并且他还将天然的脂肪酶和经过定点突变的脂肪酶催化反应的效果进行了比较,从而证明了经过修饰后的脂肪酶具有了新的功能。年,王和余首次报道了脂肪酶催化的丙酮和芳香醛之间的反应一丌
