资料收集于网络，如有侵权 请联系网站删除只供学习与交流一、包装细胞 293T 细胞的培养一、 293T 细胞的冻存1. 随着传代的次数增加， 293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等所以要在细胞 购进时就进行冻存2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率3. 倒去细胞上清液，加入 D-Hank's 液洗去残留的培养基4. 加入 0.25% 的胰酶，消化 10-20s 后倒去5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀6. 细胞计数7. 将细胞离心， 1000rpm ， 2min 8. 根据计数结果加入细胞冻存液 （70% 完全培养基 +20%FBS+10% DMSO ）重悬细 胞，密度为3X 10 6个/ml10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录二、 293T 细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到 80~90% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维 持细胞良好的生长状态2. 消化细胞，方法同上3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬密度为 3 X10 5个/ml4. 分到 10cm 培养皿中， 10ml/ 皿三、 293T 细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过 50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要 丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为 40 C3. 查看细胞库记录， 根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞 （需戴上棉手套， 防止被冻伤） ， 迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在 1~2 min 内使细胞溶液完全溶解4. 将 1ml 细胞溶液加入 9 ml 完全培养基中并混匀后转入 10cm 培养皿5. 放回37 C、3%CO 2和95%相对湿度的培养箱中培养6. 第二天观察细胞存活率倒掉旧的培养基，加入 10ml 新鲜培养基二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为 WPRE 特异引物，序列如下只供学习与交流资料收集于网络，如有侵权 请联系网站删除只供学习与交流cat. no.cat. no.cat. no. 4316844)in 帕*;Tri £luctionSunBio IV VectorPackaging Cell5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer), 5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and 5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Un iversal PCR Master Mix (Applied Biosystems 4304437)3. TaqMan DNA Template Reage nt Kit (Applied Biosystems401970)4. TaqMa n RNaseP con trol reage nt (Applied Biosystems用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268) 必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
任何时候细胞汇合率都不准达 到 100%慢病毒的包装1. 预先准备3个T150 瓶的293T 细胞，培养基为 DMEM + 10% FBS ，1% Glutamax ， 1% 青霉素-链霉素2. 将细胞分到12分到12个T150瓶中，每瓶的细胞密度是 8 X10 6个3. 第二天，镜下检查细胞细胞融合度应大致为 30-40% ，分布均匀4. 转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入 20ml的Opti-MEM 培养基，将细胞送回培养箱5. 取两支无菌的 50ml离心管，其中一支中加入 252 卩g pNLEGFP/CMV/WPREDU3载体质粒，168卩g pCD/NL -BH*DDD 包装质粒和 84卩g pLTR -G质粒，用Opti-MEM 培养基补齐到 18ml另一支中加入 500卩l Trans -EZ溶液和17.5 ml Opti-MEM 培 养基，用电动移液器轻轻混匀 将Trans-EZ 稀释液滴加到质粒管中， 边加边轻轻晃匀[IN A W .WTfflMfZ C jjTO 祝关键步骤：推荐使用 Qiagen质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒6. 室温孵育20分钟，使DNA和Trans-EZ 充分结合形成转染复合体。
7. 取1支5ml的移液管，将得到的 DNA-Trans-EZ 复合体均匀滴加入到细胞培养板 中，每板3ml来回晃动培养板，混匀后放回到 5%二氧化碳培养箱每一皿细胞培养 盘不要超过6盘8. 6小时后，移去细胞上清，更换为 17ml的DMEM完全培养基9. 转染后一天观察细胞，所有的细胞应当都是健康的并且密度接近 60-80% 如果所转染质粒带有 GFP荧光，那么这时候可以看到大于 95%的细胞都是带有荧光的10. 将细胞送回培养箱继续培养 2天（36-48小时）在这个过程中，细胞会逐渐融合形成多核体，大多数的细胞依然贴壁11. 收集所有的上清，分装到 50ml离心管中12.4 C, 500g离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片13.总的上清约为204 ml，用250- ml 0.45 卩m PVD过滤装置过滤如果发现滤膜 被堵住，表现为过滤速度变慢，更换新的滤器只供学习与交流慢病毒的浓缩与纯化方法一超速离心沉淀法离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫1. 取 6 个 Ultra-clear SW28外灯继续消毒30分钟2. 每个 Ultra-clear SW28 离心管中加入约 32ml 的预先处理的病毒上清液。
3. 取一支 10ml 的移液管，吸取 12 ml 20% 的蔗糖溶液将移液管一直插入到离心管 的底部，缓慢将蔗糖溶液打出 4 ml 同样地，将剩下 8 ml 的蔗糖溶液分别加入到另两 个离心管中另取一支干净的移液管，对剩下 3 管进行同样处理4. 用 PBS 调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过 0.1g 5. 按次序将所有 6 个离心管放入 Beckman SW28 超速离心转头中7. 小心将管子从转头中取出倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置 10 分钟使剩余的上清流干吸掉剩余的液滴在管底应当有可见的沉淀8. 每管中加入 100ml 不含钙和镁的 PBS 洗下沉淀9. 将 SW28 超速离心管插入到 50ml 锥底离心管中，盖上盖子10. 在4 C溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡11.4 C, 500g离心1分钟，使溶液集中于管底12. 用200卩I移液器轻柔吹打使沉淀重悬避免产生泡沫将所有管中的液体集中到 一个 SW28 离心管中13. 集中后的病毒悬液分装成 50卩I每份，保存在成品管中用碎干冰速冻后储存在-80 C 方法二 PEG-8000 浓缩法PEG （聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高亲水性，在溶液中会吸收大量水分，减少病 毒之间的距离,使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起,病毒的相对浓度提高,达到沉 淀浓缩的目的。
5X PEG8000+NaCI 配制 称取 NaCI 8.766 g; PEG8000 50g 溶解在 200mI MiIIi-Q 纯水中； 121 摄氏度 30min 湿热灭绝 30min ；保存在 4 C 1. 使用0.45 ym滤头过滤慢病毒上清液；3. 每20〜30min 混合一次，共进行 3-5次；4. 4 度放置过夜；5. 4 度, 4000 g ,离心 20min ；6. 吸弃上清,静置管子 1 〜 2 分钟,吸走残余液体；7. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；8. 集中后的病毒悬液分装成 50卩每份，保存在成品管中用碎干冰速冻后储存在-80 C病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位： TU/ml ，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数 ”TU”为” transducing units ”的缩写， 中文为 “转导单位 ”，表示可以感染并进入到靶细胞中的 病毒基因组数第一天 细胞准备将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至 1X 105/ml ,加入96孔板，100卩1/孔,为每个病毒准备10个孔放入37 C, 5%CO 2培养箱中培养第二天 加病毒在 EP 管中做 10 倍梯度稀释，连续 10 个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备 10 个1.5ml EP 管，每管加入90卩1培养液，往第一个管中加入 10卩1病毒原液，混匀后，吸取10^1加入第二个管混匀依此类推，做十个稀释度（ 10~10 -8 ）吸取 96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液并做好标记第三天 追加培养液在每个孔再加入100卩1完全培养液，利于细胞的生长第五天 观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数假设为 X 和 Y，则滴度（TU/ml ） = （X+Y*10 ） *1000/2/X 孔的病毒液的含量（卩）定量 PCR 法病毒感染1天前，取6孔板接种HOS细胞每孔细胞为 5X 10 4个接种细胞 24 小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目， 记为 N 弃去其他培养板中的培养基，更换为含有 5卩g/ml polybrene 的新鲜培养基将浓缩病 毒用培养基稀释200倍，也就是取1卩1病毒加入到199卩1的培养基中在3个培养孔 中分别加入0.5卩1, 5^1和50 ^1的稀释病毒感染开始后20小时，除去培养上清，换为 500^1含DNasel （Takara Mirus Bio ，终浓度为 10 U/ml） 的新鲜培养基。
在 37 C 消化 15 分钟，这一步是要除去残余的质粒DNA 然后换为 2ml 正常的培养基，继续培养 48 小时用0.5ml 0.25% 胰酶-EDTA溶液消化细胞，在 37 C放置1分钟用培养基吹洗下，离心收集细胞按照DNeasy试剂盒的说明抽提基因组 DNA每个样品管中加入 200 ^1 洗脱液洗下 DNA用DNA定量试剂盒定量(Bio-Rad )基因组 DNA可以稳定保存在-20 C至少2个月准备PCR所需的试剂和样品为病毒序列检测引物配总管 I :2 X TaqMan Master Mix25 卩 l X nForward primer (100 pmol ml-1)0.1 卩 l X nReverse primer (100 pmol ml-1)0.1 卩 l X nProbe (100 pmol ml-1)0.1 卩 l X nH2O19.7 卩 l X nn = number of reactions. 例如：总反应数为 40 ,将 1ml 2 XTaqMan UniversalPCR Master Mix , 4 卩 l forward primer , 4 卩 l reverse primer , 4 卩 l probe 和 788 卩 l H2O混和。
震荡后放在冰上为人基因组序列检测引物配总管 n :2 X TaqMan Master Mix25卩lX n。