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1、激光扫描共聚焦显微镜ZEISS 780操作规程本设备属于精密设备，操作人员必须提前熟悉其适用范围、结构、性能及其具 体操作方法，未经操作培训者不能进行上机操作。通过操作培训的人员必须严格按 照仪器管理老 师的培训要求及设备使用说明书指定的操作进行工作。1.开机提前进行镜检， 确保样本无误； 查看空调温度、 抽湿机湿度和不间断电源工作情况。匸1开三相稳压电源。注意：先开稳压电源后面的黑色扳手开关 ，再按下稳压电源前面的绿色按钮 ，如果出现报警声，请马上关闭稳压电源，并报告管理人员。12两分钟以后依次打开电源控制板上的三个开关。先打开主开关main switch，再依 次打开SYSTEMS/PC和
2、COMPONENTS开关。注意：各个开关不要同时按下，开 机时仪器会进行自检，每按下一个开关，请等待相应的部件自检完毕 后再开下一个开关。3打开电脑开关，点击“LSM User”图标，进入桌面；当看到桌面右下角显示“注意安全”图标时，方可点击桌面中央的ZEN软件图标；然后点击“Start System ”按钮开启软 件。注意： 当桌面右下角始终不显示 “注意安全” 图标时，不可启动软件。这时把电脑 主机左边那台仪器的盖子掀开，按一下“ Reset”按钮，等待电脑桌面右下角出现“注意安全”图标。4打开氩离子激光器（若不使用458nm或488nm或514nm激光线则不需要打开）。先 打开氩离子激光
3、器正面的开关ON，再顺时针旋转钥匙至“一”的方向，等待绿色指 示灯亮起 方可开启光路 （大约 5-10min）。注意：Ar+激光器在启动后，需要1h左右的预热时间才能进入稳定状态。若闲置时间1h以上，可将激光器扳钮由“ laser run”位置扳至“idle power ”处，保护激光器，延长使 用寿命2找目标2-1在明场下用Transmitted light找目标，点击、GFPCFP Rhod CMCBF注意： 如果实验只使用空气镜，放置样品后，建议先选择低倍物镜找细胞，再换用 高倍物镜微 调即可。切记调焦和移动前后、左右的滑竿时，不要太快太猛，以免物 镜顶到样品或载物台，这 会严重磨损和划
4、花镜头，甚至碰碎镜头！ ！切记： 显微镜左、右两边的粗准焦螺旋上方各有五个按钮，如果不知道它们各自的 功能不要碰 触，否则可能关闭明场灯源，无法用眼睛找细胞。水、油镜使用注意：如需使用水镜或油镜，水、油不要滴太多，以免从镜头边缘流入物镜内部污染镜头。换细胞前后不要反复擦拭镜头，擦拭过多容易磨花镜头，降 低透过率， 般 两三个样本 后再追加一滴水或油即可。实验结束后先用擦镜纸将油 擦尽，再用无水乙醇清 洁。洁。2.2 在荧光下用 Reflected light 找目标，先打开汞灯电源，然后点击上图片中的、一、除非实验转染的荧光蛋白效率稍低（镜检时发光的目标不多，但仍然可以进行 试验），否 则一般
5、不要开汞灯，汞灯寿命有限。二、经镜检确定需要使用汞灯的标本，样本放置好后再打开汞灯电源。集中观察， 节省时间保 护光源；快速寻找目标观察，保护样品不被淬灭。切记：不可频繁开关汞灯， 汞灯点燃后至少 15 分钟汞蒸汽才完全蒸发， 因此打开汞 灯后至 少要 30分钟后才可以关闭汞灯电源， 汞灯关闭后不能马上再次打开使用， 至 少一小时 以后 等灯泡完全冷却后再开。3. 激光扫描图像获取：用眼睛找完细胞以后，要切换到激光扫描模式来获取图像。依次点击上图片中的：、按钮。切记：从找细胞切换到图象扫描，一定要记得点击，否则容易损坏 仪器。3.1 光路选择设定 ：、新设置光路：点击下图中的Smart Set
6、up按钮，选择自己所用的荧光探针，设 定所需的颜色，然后点击Best signal，点击Apply按钮。注意： 如果使用 Ar+ 激光器 , 点击 Apply 前, 先确定激光器上的 绿色指示灯亮起。en之前实验所得的一张图片，点击页面最下方o同样注意：如果使打开的那张图片的参数。的Resue按钮，此时软件的一切参数均、使用原来的光路: File 中二、自己设置光路：需要知道所使用光蛋白或燃料的激发光谱和发射光谱。在卜光器一 上的绿色指示灯亮用Ar+激光器，点击Apply前，先确定激4.扫描参数设定：光路设定后， 点击上图中的 Live 按钮，预览找目标。此时可以移动样品， 微调焦， 调针 孔
7、大小，调图像荧光亮度，调透射图 T-PMT 亮度，调噪音等。 调好图像后，点 击 Live 处的 红色 Stop 按钮停止预览， 再点击 Snap 按钮拍照。 切记：预览结束后一 定要先 Stop ， 再点击Snap,否则很容易死机。rt3 z b9jnfn激光器输出功率的调节要注意 ：激光器的输出功率越高，荧光图像和透射图图像就 越亮，但会 造成荧光样品的光漂白，长时间扫描或对荧光性质不稳定的染料尤其明 显，所以实验中尽量不 要把激光器的输出功率调的太高。调节激光器的输出功率时 要 逐步调节，不要一下子将光标拖 到需要的功率，否则容易损坏激光器或AOTF(声光调节滤光片 ) 。Pinhole
8、 的调节要注意： Pinhole 越小， 图象的分辨率越高， 但探测器收集到的荧光 也越 少，图像亮度就越小，一般先选1AU,如果图像过暗可适当增加。使用多通道（多Track ）时,应使每个Track里设置的pinhole大小一致（optical slice 致），以保证不同通道探测的都是细胞同一层面的荧光；增益 Gain （Master） 的调节要注意： Gain （Master） 的设置不宜太高，原则上增益 不 要超过 800，同时 Gain 设置太高也会导致背景过高，降低图象的信噪比。如果信号 太弱，可 以适当调高放大器的增益（ Digital Gain ），其默认值为 1，例如可以调高
9、 到 1.5左右（不 要超过 2 ）。背景Digital offset的设定原则：图象最亮点不超过饱和值256 （显示红色），图象背景处的 蓝色雪花点不宜太多（蓝色表示信号强度为零） 。注意：准备样品的时候，请将探测通道先关闭（即将Track前的符号“丿”去掉），这样 高压包上没有加电压，可以起到保护高压包延长寿命的作用。5. 关机（与开机顺序相反）1关汞灯： 如果使用了汞灯，先把汞灯强度调到最小，再关闭开关OFF。2. 关激光器： 如果使用了 氩离子激光器 ，在实验完成后，先将氩离子激光器正面的 钥匙逆时针旋转至“丨”的方向，等待排风扇停止工作（大约5-10min ），再关闭开关OFF。 其它激光器直接在软件（ Laser ）中关闭。3. 退出系统软件。4. 关闭电脑。5. 依次关闭电源控制板上的三个开关：COMPONENTS、SYSTEMS/PC和MAINSWITCH 。6. 最后关闭三相稳压电源。6. 卫生：1. 倒掉除湿机的水，重新打开除湿机。2. 做好使用记录 ，清洁台面，将废弃物带出实验室3. 吸尘器清理地面和狭缝。4. 用仪器罩盖好仪器。5. 锁门。
