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1、赛润 ELISA classic肺炎支原体 IgG/IgM/IgA目录1.用途2.诊断意义3.赛润 ELISA classic-检测原理4.试剂盒组成5.检测所需物质，试剂盒未提供6.储存和稳定性7.赛润 ELISA classic的检验步骤 7.1注意事项 7.2样品准备和储存 7.3试剂盒反应试剂的准备 7.4检测程序概要 7.5检测过程8.检测结果评估8.1 4PL单点定量法 8.2检验有效性标准8.3计算赛润 ELISA classic肺炎支原体 IgG/IgM/IgA（定量） 8.4检测结果分析9. 性能特性 9.1重复性 9.2 敏感性和特异性10.警告 10.1警告和安全措施 1
2、0.2废料处理11.参考文献赛润 ELISA classic肺炎支原体IgG/IgM/IgA 酶联免疫法测定人体抗体（IgG/IgM/IgA）- 只限用于体外诊断-IgG试剂盒（定量） 编号 ESR127GIgM试剂盒（定量） 编号ESR127MIgA试剂盒（定量） 编号ESR127A检测评估标准: BEP 2000, BEP III, DSX, 手动操作1.用途 赛润 ELISA classic肺炎支原体IgG/IgM/IgA用于定性和/或定量检测人血清或血浆内肺炎支原体。抗肺炎支原体病毒IgG，IgM和IgA联合使用会有助于对肺炎支原体感染做出确切的诊断。IgA-Elisa的使用特别在诊断
3、再感染时，对于IgG 和IgM诊断是一个重要的补充。2.诊断意义 支原体肺炎病毒的感染会导致许多有可能引起严重并发症的呼吸系统疾病。在这些疾病中首先值得一提的是初级非典型肺炎，咽炎以及呼吸道支气管炎。在美国支原体肺炎病毒的感染要占每年门诊肺炎的20%。肺炎支原体感染的临床症状具备多样性并且与其它原因引起的呼吸道感染（如呼吸道合孢病毒，流感-感染等）很难区别。肺炎支原体可使气管、支气管以及细支气管上皮细胞增生。感染后10-20天之后才出现一些非特异症状，如头疼、发烧、无痰干咳等。在感染期限间还可能会发展成间质性肺炎。大龄儿童和小龄成年人门诊肺炎的15-20%来自肺炎支原体病毒。在儿童中观察到病毒
4、性感染（如麻疹）或细菌性感染（链球菌肺炎）后的肺炎支原体的重复感染。小龄儿童（5岁）中肺炎支原体感染经常无症状而消失或只导致轻度呼吸道感染。由于感染后没有足够的免疫力存在，会出现需要长时间康复期并不断加重的再感染（多次）。正因为这些不同症状的存在，诊断不能仅靠临床现象进行，而需要进一步地确诊（如病原体证明，血清学等），以便进行相应的治疗。肺炎支原体感染的病理学以支原体与呼吸道上皮细胞粘结，以在宿主细胞上滑动和宿主高细胞免疫活性为基础。（细菌凝集素和人宿主细胞的同源性很有可能可以预防凝集，降低细胞免疫活性进而组织上皮细增生）。肺炎支原体感染的免疫反应可以描述如下：IgM-抗体是在发生特殊症状后约
5、7天之后可以被检测到。在首发症状后的10-30天后可以检测到最大的IgM-抗体浓度。12-26周后IgM-抗体的滴定度将降低到无法检测的程度。IgM-抗体最频繁地出现于初期感染阶段，因此，在较年轻患者中能测到高浓度的IgM-抗体，而在大龄患者（很有可能再感染了的）中几乎测不出或测到极微乎其微的IgM-抗体。正由于其常有的再感染，IgM-抗体会被削弱并降低到检测不到的水平。在刚刚被感染的情况下，IgA-检测的结果清楚、敏感。大量的抗体形成于出现感染症状的3周内，从出现感染症状第5周起IgA和IgM抗体浓度下降。IgA-抗体浓度下降的速度比IgM-抗体的浓度更快。肺炎支原体感染IgG-抗体的出现要
6、比IgA-抗体和IgM-抗体晚。它在发病第5周后才达到最大浓度。因为IgG-抗体反应是肺炎支原体感染最可靠，也是最晚期的反应，所以仅有IgG检测通常被视作确诊的标志。急性感染很少会有无IgA-抗体和IgM-抗体产生的情况。在这种情况下，诊断应更依赖于IgG-抗体的检测。CFT试验是应用最为广泛的诊断肺炎支原体-感染的血清学方法。它最致命的缺点就是由于全细胞抗原制备中LPS-分子交叉反应导致的低异性。显而易见地，具有较高特异性的结果来源于使用特制抗原的Elisa方法（如P1 肺炎支原体的粘结）。3.赛润ELISA classic-检验原理用抗原包被微量板孔，制成固相载体。加患者血清到板孔中，其所
7、含的抗体特异性地与固相载体中存在的抗原结合，形成免疫复合物。除去多余物质后，加入碱性磷酸酶标记的IgG、IgA和IgM抗体，使之与上述免疫复合物反应。洗板，除去多余的结合物，加入底物（对硝基苯磷酸盐）。该反应产生有颜色产物，颜色强度与特异性抗体含量成正比。4.试剂盒的组成试验成分IgG试剂盒 IgM试剂盒 IgA试剂盒 数量 / 剂量微孔条（此微孔条可掰开单独使用，每条有8孔，共96孔，已经包被了抗原）1个微孔条框架包被的抗原为灭活抗原12 12 12标准血清（立即可用）人血清溶于含蛋白的磷酸盐缓冲液；抗HIV抗体、抗乙肝病毒（HBV）表面抗原和抗丙肝病毒（HCV）抗体均为阴性；防腐剂：0.1
8、% 叠氮化钠染色剂：紫红色O22毫升 22毫升 22毫升阴性质控血清（立即可用）人血清溶于含蛋白的磷酸盐缓冲液；抗HIV抗体、抗乙肝病毒（HBV）表面抗原和抗丙肝病毒（HCV）抗体均为阴性；防腐剂：0.1%叠氮化钠染色剂：里沙明绿 V12毫升 12毫升 12毫升酶标记的抗人IgG, IgA, IgM （立即可用）羊抗人IgG, IgA, IgM（多克隆），碱性磷酸脂酶，以蛋白稳化溶液加以稳化。防腐剂: 0.02%甲基异噻唑啉酮 0.02%溴化硝基二垩烷13毫升 13毫升 13毫升浓缩洗液（可稀释至1000毫升）氯化钠，含吐温20和30mM Tris 防腐剂： 0.1%叠氮化钠133.3毫升 1
9、33.3毫升 133.3毫升稀释缓冲液磷酸盐缓冲液，内含蛋白和吐温20防腐剂： 0.1%叠氮化钠0.01克/升的溴酚蓝钠盐250毫升 250毫升 250毫升终止液1.2N 氢氧化钠15毫升 15毫升 15毫升底物（立即可用）邻硝基苯磷酸盐，不含其它溶剂的缓冲液防腐剂：浓度小于0.1%的叠氮化钠（瓶子未盖好底物可能会轻微变黄，但不会影响其质量）13毫升 13毫升 13毫升带有标准曲线和评估表的质量控制认证文件（抗体以IU/毫升或U/毫升计量）1 1 15.其它检测所需物质- 普通实验室所需的仪器装置- IgM检测：赛润类风湿因子Rf吸附剂（产品编号Z100/5ml和Z200/20ml）- 分光光
10、度计，波长405纳米，建议参考波长范围620纳米- 690纳米（例如 650纳米）- 37温箱- 湿盒- 蒸馏水。6.储存及稳定性试剂储存稳定性微孔条（抗原）开封后放在2-8装有干燥剂的密封铝箔袋中。有效期内质控血清 / 标准血清开封后保存于2-8。有效期内；18个月酶标记抗体立即可用的溶液于2-8储存。避免污染（使用无菌针头）。有效期内24个月稀释缓冲液 开启后于2-8储存。有絮状时丢掉未开封18个月有效期内36个月洗涤液浓缩液开封后保存于2-8。工作液在2-8。工作液在室温下。盛过工作液的瓶子应按常规方法清洗，并丢弃混浊溶液。有效期内2星期1星期底物2-8储存，避光。避免污染（使用无菌针头
11、）。当溶液变为黄色时应予以丢弃（水作空白，吸光度大于0.2时）。有效期内24个月终止液开封后保存于室温下。有效期内7.赛润 ELISA classic的检验步骤7.1注意事项只有全部使用赛润 ELISA classic试剂才能保证检测效果，因为所有试剂都是有关联的，不能混用其他制造商的产品。尤其是标准血清，对照血清以及酶标记物，必须使用试剂盒配备的，不要使用其它批号产品。稀释缓冲液，洗液，终止液和底物溶液可用于所有赛润 ELISA classic试剂盒。ELISA classic试剂盒内所有试剂均必须正确地存放。应在未开封的情况下，保存于2-8，并在有效期（见标签说明）内使用。详细的稳定性和储
12、存资料在“6. 储存及稳定性”内将加以详述。每一种试剂都是经过校准以保证最佳的检测结果。这些试剂如果未经规定被稀释或改动都会导致检测的敏感度的降低。在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。应按照规定刻度截断微孔条。当装微孔条的铝袋开封后，应及时用夹子夹紧，否则不可使用。开始试验前，将所有试剂置于室温。从试剂管中吸取试剂的时候，应注意使用无菌技术以防污染。为避免假阳性结果，吸加酶结合物时，吸嘴应确保不接触或喷洒于小孔的外面，注意不要盖错瓶盖或管盖。试验结果的可重复性依赖于充分混合试剂。使用前
13、振荡装有对照血清的小管和所有稀释过的溶液（例如使用混合器）。小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 / 对照血清，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。只有严格遵守赛润ELISA classic试剂的试验说明才会得到最佳的检测结果。如果实验中未严格遵守质量控制认证文件上的有效性特异准则，则试验结果无效。洗涤不充分将影响试验结果：应该小心进行洗涤。洗涤步骤应遵守相关洗涤器（平底孔，孔直径7毫米，深10.9毫米）指导手册进行。重要的是所有的孔内均应加入相同体积的洗涤缓冲液。洗涤
14、结束时，应将微孔板倒扣于纸巾上并轻轻敲打，以确保所有孔内均无洗涤缓冲液。避免产生泡沫！如果使用自动洗板机，注意正确操作。7.2样本准备储存虽然，在检验中不会产生副影响，但为避免干扰结果，应保留使用高血脂的、溶血的或污染的血清。样品不应加热灭活。7.2.1样品稀释开始试验前，患者的待测样品必须以稀释缓冲液稀释如下（V1+V2）：V1+V2=1+100 加 10微升 患者待测样品于 1000微升 稀释缓冲液稀释后及加入微孔板前，样品必须充分混合。类风湿因子干扰 类风湿因子抗体是IgM的自体抗体，可与IgM免疫复合物结合。非特异性IgM抗体（风湿因子）的存在将导致IgM检测的假阳性结果。另外，也存在弱结合的病原体特异性IgM抗体被强结合的IgG抗体取代的可能性。在这种情况下，IgM的检测将得到假阴性的结果。因此，在进行IgM检测前应用类风湿因子吸附剂对血清作预处理。（赛润类风湿因子吸附剂，产品编号Z100 (5ml/25样品)及Z200（20ml/100样品）。7.2.2样品储存密封的患者
