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1、实验六 作物抗病性鉴定作物抗病性鉴定(evaluation of disease resistance )是作物抗病育种的重要基础，从抗原筛选、后代选择、直到品种推广的全过程都离不开抗病性鉴定。狭义的抗病性鉴定是评价寄主品种、品系或种质对特定病害抵抗或感染程度，广义的抗病性鉴定还应包括病原物的致病性评价。鉴定方法包括自然鉴定、接种鉴定、田间成株鉴定、室内苗期鉴定、离体鉴定及间接鉴定等，在实际工作中则需根据作物、病害种类，目的要求和设备条件而定。常用方法如下：1、田间自然鉴定 自然发病条件下的田间鉴定是鉴定抗病性的最基本方法，尤其是在各种病害的常发区，进行多年、多点的联合鉴定是一种有效方法。它能
2、对育种材料或品种的抗性进行最全面、严格的考验。田间鉴定的方法因作物种类而异，大田作物的田间鉴定一般要进行人工接种，接种方法又因病菌而异。对于稻瘟病等气传病害，可分别用涂抹、喷雾及注射等方法进行接种，以使具有抗接触、抗侵入等抗病机制的品种也得以发病。2、温室或田间接种鉴定 这种方法是将病原菌孢子或病毒直接接种到温室或田间植株的叶片、果实或根上，它适合对所有作物进行抗病性鉴定。由于抗病现象是寄主、病原物及环境条件三者共同作用的结果，因此，这种鉴定结果也能真实地反映被鉴定材料的抗病性，可靠性强。接种鉴定的技术规程包括育苗、接种体的制备(病菌的分离、保存与抱子诱发)及接种3个环节，接种的方法有点滴法、
3、喷雾法、摩擦法及注射法等。3、离体接种鉴定 为鉴定以组织、细胞或分子水平的抗病机制为主的病害，可选用离体接种鉴定。具有操作简便，鉴定结果可靠等优点。可同时分别鉴定同一材料对不同病原菌的抗性。因直接从植株上取下子叶、叶片或果实进行鉴定，不影响幼苗正常生长发育和开花结实。鉴定方法不仅因作物、病菌种类而异，而且抗病性分级标准也因作物、病原菌的种类不同而存在很大的差别。以下则针对水稻稻瘟病、小麦条锈病、玉米大斑病等部分主要作物的最重要病害分别学习各种鉴定方法和技术。I 水稻苗瘟抗性的鉴定一、实验目的1、熟悉水稻苗期稻瘟病的症状特征。2、学习和初步掌握水稻苗瘟抗性鉴定技术。二、内容说明水稻稻瘟病是一种世
4、界性的真菌病害，被列为水稻三大病害之首。水稻稻瘟病具有传播快、发生范围广、流行频率高、灾变严重等特点。在我国水稻各稻区常年均有不同程度的发病，给水稻生产带来极大的损失。稻瘟病原菌（图6-1）为稻梨孢菌（Pyricularic oryzae），无性世代：Pyrcularia grisea Sacc.，半知菌亚门梨孢属。有性世代：Magnaporthe grisea Barr Yaegash，子囊菌亚门。分生孢子梗不分 枝，从寄主表皮或气孔伸出，具28个隔膜，基部稍膨大，淡褐色，向上色淡， 图6-1 稻瘟病原菌顶端曲状，上生分生孢子。分生孢子无色，洋梨形或棍棒形，常有13个隔膜，基部有脚胞。我国稻
5、瘟病菌有7群43个生理小种，为ZA群、ZB群、ZC群、ZD群、ZE群、ZF群和ZG群，其中ZG小种为优势小种，分布最广。 稻瘟病在水稻整个生育阶段皆可发生，具有为害时间长、侵染部位多和症状多样性等特点。按其为害时期和部位的不同，可分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟和谷粒瘟，其中以穗颈瘟对产量的影响最大。稻株容易感病的生育期是4叶期、分蘖期和抽穗期。品种是稻瘟病发生和流行的基础。稻瘟病菌群体大、繁殖快，其高度的变异性使新的生理小种不断更替出现，导致选育的高抗品种很容易丧失抗性。因此，必须坚持长期研究病原菌的变化，并不断地选育新的抗病品种。温度和湿度是影响稻瘟病发生流行的主要环境条件，以气温为2528对
6、菌丝发育、分生孢子形成最为适宜，相对湿度96%最适合病菌孢子的形成和侵入。阴雨连绵，日照不足或时晴时雨，或早晚有云雾或结露条件，病情扩展迅速。光照对孢子形成、萌发及侵入都有抑制作用，缺氧时孢子不能萌发。在饱和湿度和适温条件下，病菌侵入稻叶后经4d的潜育期就可出现病斑。偏施过施氮肥有利发病。放水早或长期深灌根系发育差，抗病力弱发病重。稻瘟病的抗性鉴定方法可分自然诱发鉴定和人工接种鉴定两种。其中人工接种鉴定根据菌株的接种方式不同，又可分为： 抗谱测定，即多个菌株单个接种； 多个菌株混合接种。自然诱发鉴定适于苗瘟、叶瘟穗、颈瘟和枝梗瘟鉴定，人工接种鉴一般适于对苗瘟和叶瘟的鉴定。一般来说，苗瘟与穗瘟有
7、极显著正相关，因而抗瘟性鉴定常采用苗期人工接种鉴定。但人工接种鉴定时，一般应用多个种群代表小种的混合菌种，以增加鉴定准确性和普遍性。三、材料仪器药品1供试材料 供试水稻育种材料若干以及抗病对照品种和感病对照品种各一个。 供试稻瘟病菌菌种 从当地搜集分布广、致病力强的主要稻瘟病菌的代表性生理小种若干个。分别进行小种培养繁殖。2仪器用品 病菌培养器具 高压灭菌锅、超净工作台、酒精灯、恒温培养箱、三角瓶（或茄子瓶)、培养皿、接种环、搪瓷盆、纱布等。 菌液接种和制备器具 显微镜、载玻片、盖玻片、搪瓷盘、普通专用喷雾器或医用喉头喷雾器、医用皮下注射器、橡胶管和保温、保湿的遮荫设备。3病菌培养基 酵母淀粉
8、琼脂培养基（酵母2g、可溶性淀粉10g、琼脂1520g，加水1000ml）。 大麦或高粱种子。四、方法步骤（一）人工接种鉴定1菌种制备 将供试稻瘟病菌菌种各生理小种分别培养，混合接种。2病原菌培养繁殖 培养方法包括一级培养繁殖和二级培养繁殖两个步骤： 一级培养繁殖 采用酵母淀粉琼脂培养基培养。方法为：将琼脂1015g放入1000ml水中加热溶化，再加可溶性淀粉（或煎糖）10g，酵母2g，装入试管，经消毒灭菌后，取出制成斜面，接种病原菌，放在2628恒温箱中培养10d左右即可取用。 二级培养繁殖 将病原菌转移到大麦（或高粱）粒培养基上进行培养扩大繁殖，用于接种鉴定。其方法是将大麦粒加水后煮到半熟
9、状态或用水浸泡24h，然后倒去多余的水分，装入三角瓶内（或茄子瓶），高压灭菌，灭菌后立即将麦粒摇散防止结块。然后在无菌操作条件下接种病菌，放在2628恒温箱内培养。培养45d时应摇动三角瓶内的大麦粒，使菌丝生长均匀。待灰色菌丝长满大麦粒并开始变黑时，用自来水冲洗大麦粒上的菌丝，随后摊放薄层于搪瓷盘中，盘上覆盖12层纱布以保湿，置于2528变温条件下培养2d左右，即可见到麦粒上产生大量灰色的分生孢子，就可供接种使用。扩大繁殖时，应注意搪瓷盘内的湿度不宜过高，否则只长菌丝，较少产生分生孢子。3育秧 前期准备 每个盘中同时安排感病和抗病品种作对照。将各供试水稻材料的种子进行粒选，各取3040粒种子，
10、经消毒、冲洗、催芽后准备播种。 培育方法 在盛有肥沃泥土的搪瓷盘中育秧。幼苗2叶期定株，每个材料选留10株生长一致的秧苗。定株后酌施23次氮肥，最后一次施氮肥应在接种前34d施用，使幼苗生长嫩绿。如采用注射接种鉴定法，可在秧田中育秧，移植于大田后进行接种鉴定。4接种 喷雾接种 一般在34叶期。日平均气温2528和阴雨高湿，叶面长时间（12h以上）常有水珠的时期接种，最有利于发病。具体步骤是：将产生不同病菌小种孢子的大麦粒放入盛有自来水的烧杯中搅拌，分别配制成孢子悬浮液，用100倍显微镜检孢子密度，平均每个视野应有孢子2025个（孢密度则为2025万个/ml）。然后将不同生理小种的孢子悬浮液混合
11、，用于接种。采用专用喷雾器喷雾接种。喷雾时要将叶片充分均匀湿润。接种后，在2628下，用薄膜覆盖保湿24小时。然后移至室外，在2030下保持高湿，培养7天，进行病情鉴定。 注射接种：一般在水稻67叶期分蘖进行，接种的分蘖必须有一张未展开的嫩心叶。将按上述方法配制好孢子悬浮液，使用医用皮下注射器从叶鞘外侧注入孢子悬浮液，直到多余菌液从心叶中冒出为止。接种后7d调查植株的发病情况。（二）自然诱发鉴定该方法适于多雾天气和阴雨的条件下的稻瘟病重病区，可种植鉴定材料，采用自然诱发抗病鉴定。具体操作：将鉴定材料种植在重病区肥沃土壤上，施氮水平略高于当地丰产田。如有必要可进行人工田间接种，以诱导发病。每个鉴
12、定材料一般栽植1020丛，可移栽或直播，重复三次。以当地抗、感品种作对照。在鉴定区周围应种植若干行咸感病的品种作诱发行，以增加感染强度。保持高湿条件。（三）病情鉴定一般是接种后7d即进行病情鉴定，或当感病对照品种达到高度发病时调查。并按全国水稻稻瘟病抗病性鉴定分级标准（见表6-1）逐株鉴定和记载，表6-1 苗瘟和叶瘟抗性分级标准级 别抗性类型症 状RMS抗病中抗感病叶片上未见病斑或产生针头状或稍大褐点叶片上产生圆形或椭圆形病斑，中间灰白色，边缘黄褐色，病斑大小在两叶脉之间，病斑直径在3mm以内叶片上产生典型梭型病斑，中心灰白色，边缘黄褐色，病斑超过两条叶脉间的宽度然后用加权法求其平均病级。国际
13、水稻研究所采用10级制稻瘟病抗性分级标准（见表6-2）。表6-2 苗叶瘟抗性分级标准（IRRI）病 级受害情况抗性水平0123456789叶上无病斑病斑为针头大小的褐点褐点稍大圆形至椭圆形的灰色病斑，边缘褐色，病斑直径12mm梭形病斑，长12cm，通常局限于两条叶脉间，受害面积不超过叶面积的2%梭形病斑，受害面积不超过叶面积的10%梭形病斑，受害面积为叶面积的1125%梭形病斑，受害面积为叶面积的2650%梭形病斑，受害面积为叶面积的5175%全叶枯死高抗（HR）抗（R）中抗（MR）感（MS）感（S）高感（HS）五、实验作业1分组进行稻瘟病的苗期人工喷雾接种鉴定。先配制病菌孢子悬浮液，在100
14、倍显微镜下检查孢子液浓度，即检查3个视野内的孢子数，明确是否符合所要求的孢子悬浮液。2进行喷雾接种和喷雾接种后的保温、保湿和遮光等管理工作。3接种7d后，进行发病情况检查，确定供试水稻品种的抗性。4水稻抗瘟性鉴定应注意哪些问题?II 小麦条锈病抗性鉴定一、实验目的1、熟悉小麦条锈病的症状特征。2、学习和初步掌握小麦条锈病抗性鉴定技术。二、内容说明小麦锈病俗称黄疸、麦疸等，分条锈病、叶锈病和秆锈病三种，其中条锈病是我国发生范围最广、危害最重的麦类病害，一般减产25%75%，也是东北地区限制小麦增产的主要因素。小麦条锈病主要发生在叶片上，其次为叶鞘和茎上，穗部颖壳和茎上也可发生。症状如图6-2。病
15、原菌为条形柄锈菌（Puccinia striiformis West），担子菌亚门柄锈菌属。夏孢子球形或卵圆形，淡黄色，尺度为1828微米1824微米，壁厚l2微米，表面有微刺，发芽孔排列不规则（如图6-3）。冬孢子梭形或捧形，双细胞，横隔处有缆缩，顶端平截或略圆，褐色，下端色浅，尺度为3053微米1220微米，顶端壁厚35微米，具短柄（如图6-4）。 图6-2 条锈病症状 图6-3 条锈病夏孢子堆 图6-4 条锈病冬孢子堆条锈病的发生流行，取决于小麦品种的抗病性、菌源和菌量及气候条件。选育和栽培抗锈品种是防治小麦锈病危害的一项最基本、最有效的措施，近几年来，随着小麦群体多样化的实施，具有累加毒性、毒性谱更宽的条锈病菌新的毒性小种的不断产生和发展，许多小麦高抗品种逐渐丧失其抗病性，使我国大面积小麦生产品种而临严重的抗
