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1、免疫印迹(Western Blot )是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体 进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新 基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。Western Blot 技术：一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显 色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体 (例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应， 再与
2、酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影 以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应 用于检测蛋白水平的表达。二分类western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验 条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。 只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下(二抗用HRP 标记)：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使 胶片曝光，就可洗出条带。三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N-亚甲双丙烯
3、酰胺，应以温热(以利于溶解双 丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N N -亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺 1g，加H20至100ml。)储于棕色瓶，4弋避光保存。严格核实PH 不得超过7.0,因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期 不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS , 1mlH2O去离 子水配制，室温保存。3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris 和 48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到
4、100ml终体积。过滤后40C保 存。4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris 溶于 40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到 100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制 备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。5、TEMED原溶液N, N , N N四甲基乙二胺催化过硫酸铵形 成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑 制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由 基。去离子水配制数ml，临用前配制.6、SDS-PAGE 加样缓冲液:pH
5、6.8 0.5mol/L Tris缓冲液 8ml，甘油 6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇 3.2ml，0.05%溴酚蓝 1.6ml， H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水 终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100pg。7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris , 188g甘氨酸，10gSDS，用 蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极 缓冲液。临用前稀释10倍。&转移缓冲液:配制1L转移缓冲液,需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris 碱、0.37g SDS，并加入2
6、00ml甲醇，加水至总量1L。9、丽春红染液储存液丽春红S 2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g 加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使 用后应予以废弃。10、脱脂奶粉5%(w/v)o11、NaN3 0.02%叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶 液(PBS)o12、Tris 缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5), 500mmol/LnaClo13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、过氧化物酶标记的第二抗体。15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)o16、BCIP(溶于 100
7、%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。18、100mmol/L NaCl。19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)使用细胞裂解液，对 贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。然后测定每个蛋白样品的 蛋白浓度。2. 电泳(Electrophoresis) SDS-PAGE 凝胶配制 SDS-PAGE 凝 胶(分离胶及浓缩胶)可以参考一些文献资料进行配制 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋 白上样缓冲液。例如2
8、X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用 5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的 上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲 液可以参考相关文献资料配制，100C或沸水浴加热3-5分钟，以 充分变性蛋白。(3)上样与电泳(1) 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内 即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大 小，最好使用预染蛋白质分子量标准。(2) 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝 进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置 或类似电泳装置，低电压可以设
9、置在80-100V，高电压可以设置在 120V左右。(3 )为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方 式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90 - 120分钟。 设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的 底端处附近即可停止电泳,或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电 泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。3. 转膜(Transfer)(1) 我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC 膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊 子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。 通常
10、如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为 300-400mA ,转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过 夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量 越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜 时间越短。(2) 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重 的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜的效果可 以观察所使用的预染蛋白质分子量标准通常分子量最大的1-2条带 较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染 色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成 转膜的SDS-PAG
11、E胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。4. 圭寸闭(Blocking)(1) 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤 液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步 骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。(2) 用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床 上缓慢摇动，室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在 4C封闭过夜。5. 抗孵育(Primary antibody incubation)(1) 参考一抗的说明书，按照适当比例用Western 一抗稀释液稀 释一抗。(2) 用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加
12、入稀释好的一抗，室温 或4C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果 不佳，可以在4C缓慢摇动孵育过夜。(3 )回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗 涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共 洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次 数。6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)(1) 参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀 释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。(2) 用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温 或4C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时
13、。(3 )回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤 3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。7. 蛋白检测(Detection of proteins)(1) 参考相关说明书，可使用Enlight等超敏ECL发光液来检测蛋 白。(2) 洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可 以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。8. 膜的重复利用(Membrane recovery)如果蛋白样品非常宝贵， 可以使用Western 一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。
