《Peptide pull down 方案译文.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Peptide pull down 方案译文.doc（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 Peptide Pull-down 方案 设计好的备用肽段（C端末尾加几个残基作为连接臂并且末端偶联生物素，）应被色谱纯化至纯度大于80%，等分，冻干，干燥环境下于80度储存 1 连接肽段的珠子的制备：（注意，制备的所有步骤都应在冰上或最多4度的环境下进行）1 用1mL磷酸盐缓冲液加0.1%的表面活性剂Triton X-100，冲洗400微升的亲和素珠（离心？（microcentrifuge），500RCF，30s）移去上清液，至少洗三次（洗去表面的保护剂，表面活性剂Triton X-100也促使疏水性的珠子与水相分离，否则无法得到上清液）制备两个400 L的珠子，其中一份不偶联肽段作为只有
2、珠子的对照组。用装有毛细管凝胶的移液器尖端来取上清液，从而避免移去珠子2 使100微克偶联生物素的肽段重新悬浮在400微升磷酸盐缓冲液（PBS）中这些肽段的量足够配400 L偶联肽段的珠子，做20次pulldown，如果珠子有着不同的连接生物素能力，注意将肽段和亲和素比例调整合适3 将2中制备好的400微升重新悬浮的肽段加入400微升洗过的珠子中，旋转（rotation），在室温下温育3到5h 也可在4度过夜温育4 用1 mL PBS + 0.1% Triton X-100冲洗连接了肽段的珠子至少三次，来移除未连接上的肽段5 将偶联了肽的珠子重新悬浮在400微升磷酸盐缓冲液中来制备50%的悬浮
3、液，在4度下储存若长期储存，加叠氮化钠到浓度为0.1%，4度下至少可储存1个月。甲基化修饰稳定，磷酸化修饰不稳定2 用固定好的肽段从复杂混合物中钓蛋白一些一般原则：1 在实验的每一步中都要确保蛋白酶抑制剂的使用，防止蛋白的降解。2 都应在冰上或最多4度的环境下进行。3 必须加未偶联肽的珠子作为阴性对照。4 除HEPES缓冲液外在这次试验中也可使用其他缓冲液5 所有肽段平行处理制备蛋白质的复杂混合物1 每次实验从108 数量级的细胞（问题：细胞培养）中制备新鲜核提取物，采用标准的高盐溶液提取方案 总量108 数量级的细胞一般来说基本足够了，最好用新鲜核提取物防止蛋白降解，不过提取物可先快冻在液氮
4、中再在-80C储存，从不同细胞系中提取是很重要的，因为有些蛋白在给定的细胞中表达的不是很好，此外考虑到所感兴趣的组蛋白翻译后修饰所涉及的细胞有丝分裂过程，与修饰同步的，正进行有丝分裂的细胞的核提取物是合适的，一些组蛋白连接的蛋白因子在420mM 浓度的盐溶液提取过程中不能被有效提取（比如那些和染色质连接很牢固的，这时就要考虑其他提取组蛋白方法了，比如用DNA水解酶或微球菌核酸酶来使组蛋白溶解）2调整提取物的盐浓度到150毫摩每升：利用KCl盐浓度为150毫摩每升的缓冲液D透析或利用无盐缓冲液buffer D稀释，调整体积到每毫升108 当量细胞，（总蛋白浓度约为2.5g/L）向buffer D
5、加入新制的DTT, PMSF，蛋白酶抑制剂是很重要的3 添加表面活性剂Triton X-100到提取物中使得Triton X-100浓度为0.1%Triton X-100对防止pull down过程中蛋白的非特异性连接很重要4 最大速度（13200RCF）离心15到30min，清除所有沉淀，转移上清液到干净试管中4C下我们用13200转每分的台式离心机，等待一段时间来确保所有的可见沉淀都被从核提取物中清出，彻底移去所有沉淀是非常重要的，会显著减少非特异性连接的背景水平复杂混合物与珠子的处理5 每份将80 L （50%）的未偶联的珠子溶液（含40L珠子），离心使成团（500RCF，30s），移除
6、上清液6 用500 L Buffer D(含浓度为150 mM的 KCl)将珠子至少洗一次（500 RCF，30s，移去上清液，避免移走珠子）7将制备的核提取物加到洗过的珠子中，在4度下轻轻旋转（rotation）温育30分钟若方便可以增加温育时间，然而预清理时间在超过30分后，我们再没能观察到非特异性连接蛋白背景水平的下降。而且请记住这步不能从数量上减少非特异性连接的水平（只作为对照组）8通过离心30秒使珠子集聚成团状（离心力调整为500RCF），用干净试管收集上清液来用于pull down如果需要的话，再离心除去任何残余珠子9取15 uL清澈的核提取物作为input 对照组用于之后的分析偶
7、联肽段珠子的准备10每份取40uL,50%的珠子悬浮液（含20uL珠子）偶联肽段的珠子的量可以根据蛋白与它结合的亲和力的强弱来调整，然而我们也发现当珠子体积超过20 uL只能增加背景干扰水平，不能增加特异性连接11离心使珠子集聚成团状，移除所有上清液，保证每份有着大致相同量的珠子通过离心30秒使珠子集聚成团状（离心力调整为500RCF），用装毛细管凝胶的移液管吸头移去上清液，在每次pull down试验中确保使用大致相同的已偶联肽段的珠子是很重要的，确保不同肽段之间能进行比较12用500 L Buffer D(含浓度为150 mM的 KCl)将珠子洗1-3次，移除所有上清液洗涤注意：使珠子离心
8、30秒（离心力调整为500RCF）与毛细管凝胶装载在移液管吸头最后一次洗之后要尽可能将上清液与珠子分离彻底Peptide pull-down:13将预处理过的核提取物约40uL加到20 uL的洗过的偶联肽段的珠子里14在4度条件下旋转，温育2到16hPull-down的温育时间可以取决于使用的蛋白，肽段的量以及结合的亲和力大小，为方便期间可以过夜温育，然而要发生结合的话一般2小时就足够了，在某些情况下更长的温育时间会减少特异性结合蛋白的复原15离心（500RCF 30s）使珠子集聚成团状16 转移所有上清液到干净试管中作为flow-through对照组用于之后分析17 用1 mL Buffer
9、 D(含浓度为300 mM KCl)洗珠子至少五次，弃去上清液彻底的清洗成团的珠子和彻底的将其与上清液分离是很重要的，它确保在pull-down环节中没有留下残余的未连接蛋白质，在一次成功的peptide pull-down中，关键是要把握好盐浓度的平衡，既要能洗去非特异性连接的背景干扰蛋白，又能保持相关的特异性连接蛋白18 最后一次用低渗HEPES Buffer冲洗，弃去上清液使用低浓度HEPES Buffer使得下步中用氨基乙酸洗脱时PH能稳定改变收集pull-down片段19加1到2珠子体积的Glycine（100 mM，pH 2.8，约20-40 uL ）来冲洗珠子洗脱时洗脱液的量的调
10、整取决于需要复原的蛋白量，并不是所有蛋白都能高效地用氨基乙酸酸洗下来，这时有两种选择，一是用0.5 N NH4OH + 0.5 mM EDTA碱性环境洗脱，一种是用0.5 mg/mL用磷酸盐缓冲液PBS溶着的未偶联生物素肽段洗脱（这是专一性最高的方法但是需要大量肽段）20在室温下温育10分钟使酸洗脱蛋白，温育时轻弹试管，使洗液与珠子充分混合 温育时间应当加长如果用肽段而不是用酸或碱洗21将所有洗出液转移到干净试管中（用装毛细管凝胶的移液管吸头）22重复19-21。第二次酸洗.第二次洗脱增加了和珠子相连蛋白的复原量，但可能忽略来限制洗脱液的体积，23加入1/10 体积 (4-8 uL) ，浓度1
11、 M的弱碱缓冲液Tris (pH 8.0).中和PH24加入大约4倍体积的Laemmli缓冲液于混合洗出液中，储存作为“acid-elution”组用于之后分析: Laemmli 样品缓冲液 0.2 M TrisHCl, pH 6.8, 8% SDS, 40% glycerol, 0.04% bromophenol blue, freshly added DTT to 40 mM25将酸洗的珠子重新悬浮于20 uL浓度为100 mM 的Tris 中(pH 8.0)，26加入大约4倍量的Laemmli缓冲液于洗出液中（为制胶预备），95度下煮沸5分钟使残余的连接蛋白质变性。 通过酸洗和变性收集剩
12、下的连着在珠子上的蛋白，使得被酸洗脱蛋白质和未酸洗脱蛋白之间出现了平行对照，因为可能给出的某种蛋白无法高效的用酸洗脱27最大速度离心30秒，充分摇晃？（vortex vigorously）15秒后再次离心，取所有上清液作为变性洗出液组用于之后分析分析和鉴别结合蛋白将“input”, “flow-through”（16中探针与蛋白温育后的溶液部分）, “acid-elution”（被酸洗脱的结合蛋白） 和 “denaturing-elution”（变性后被洗下的蛋白）四组进行凝胶电泳，再用银染对比，切割只出现在被修饰肽段那组的条带，用质谱分析用专一性抗体验证感兴趣的蛋白的确是特异性连接我们使用来
13、自Invitrogen 公司的SilverQuest 银染工具，小心操作胶防止角蛋白污染Materials & ReagentsPreparation of peptide-bound resin:Biotinylated histone peptides (see procedure section)Avidin agarose 1 PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.47 mM KH2PO4, pH 7.42 Triton X-100 (20% v/v原液)3 Sodium azide (10% w/v原液)Peptide pul
14、l-down from a complex mixture of proteins:1 Complex protein mixture (e.g., nuclear extract)2 Buffer D（一份KCl 150mM，一份KCl 300mM）: 20 mM HEPES, pH 7.9, 20% v/v glycerol, 0.2 mM EDTA, 0.2% Triton X-100, 新制 2 mM (DTT), 0.2 mM PMSF, protease inhibitor cocktail 3 Triton X-100 (20% v/v原液)3 Avidin agarose (P
15、ierce)5 Peptide-bound resin (50% slurry; see procedure section)6 低浓度HEPES Buffer: 4 mM HEPES, pH 7.9, 10 mM NaCl7 100 mM Glycine (pH 2.8)Optional (for base-elution): 0.5 N NH4OH + 0.5 mM EDTA8 4X Laemmli buffer: 0.2 M TrisHCl, pH 6.8, 8% SDS, 40% glycerol, 0.04% bromophenol blue, freshly added DTT to 40 mM9 1 M Tris (pH 8.0)10 100 mM Tris (pH 8.0)
