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1、科技文献翻译通过代谢工程途径重组细菌多糖Remodeling bacterial polysaccharides by metabolicpathway engineering学 号：学生姓名：指导教师：所在学院：所学专业：生物科学二o 一四年五月将结构改变这种方法引入生物分子学中，这种生物分子是一种强大方法，能够 剖析它们在生物学过程中的职能和角色。细菌多糖由于在体内结构上的修改，在很 大程度上来说是一直未开发尽管细菌多糖在细菌宿主相互作用过程中有丰富的结 构信息并占有重要的角色。在这项研究中，我们通过代谢多糖以一个高度同质的方 式混杂在核糖核苷酸生物合成途径的工程来证明单糖类似物可以变成细
2、菌的结合多 糖。此外，官能团的代谢结合使用在化学连接反应中常作为细胞表面标记物质。总 之，我们的研究代表了一般情况，是为一代新型细菌多糖量身定制的轻便有效的方 法。几乎在所有微生物的表面修饰中都有不同结构的多糖。这些多糖在细菌和周围 环境的相互作用中有着重要的作用，如细菌粘附，生物膜形成便利化，并通过模仿 主体复合物赋予主体调节免疫防御作丽。因此，病原细菌的多糖早已被作为一个 主要的致病因子。此属性已被利用，来开发针对传染病如肺炎，脑膜炎和脓毒症 等多糖为基础的疫苗。此外，在近几年已经付出很多努力，以确定小分子抑制剂十 扰多糖生物合成的新型抗生素的机制。这种将引入的结构修饰成为生物分子它代表了
3、一种能够在生物学过程中剖析 其功能和作用的重要的工具。例如，通过各种化学和遗传手段将非天然氨基酸引入 蛋白质，这种手段已经允许蛋白的表征折叠，酶的催化机制和配体受体相互作用 的发生。近日研究表明，代谢能够引进类的官能团，例如能够往哺乳动物细胞 表面引入碳水化合物的复合物，这对于在细胞的天然环境中研究糖基化来说是一门 强大的技术5。然而，与这些令人心动的研究成果相比而言，介绍修改细菌多糖的 区域从很大程度上来说是仍然未开发。迄今为止，只有极少数的例子已被证实。詹 宁斯和他的同事用化学转换方法将本-乙酰化组B群脑膜炎球菌多糖转化沏-丙酰 化衍生物，从而诱发多糖特异tIgG抗体的产生6。该组用化学方
4、法合成的一系列 细胞壁前体标记有荧光素和一氧代基团。他们发现，这些前体可以通过代谢合并在 细胞壁中。在另一个例子中，伯特森教授，吉布森和他的同事证明了体内掺入的 N-酰基可以修改为唾液酸类似物进入杜克雷嗜血杆菌细胞表面脂寡糖在这些例 子中，都表明在体外化学转化的实现具有高协调性的优势，但这些修改都是在细胞 环境中分离的。由于存在生物合成途径中自然和非自然基板的竞争，这些修改通常 是在亚化学计量数单位上进行的。因此，目前需要制定一项战略，在体内生物合成 系统中能在细胞环境中产生均匀改良性多糖。为了实现这一目标，在本研究中，我 们在大肠杆菌中证实外源性糖核苷酸补救途径，该途径不仅能在功能上取代相应
5、的 从头合成途径，同时也能在混杂代谢中使不同的糖类似物合成多糖导致产生均匀 改性结构（图1A）。此外，这项研究注册成立将允许进一步的化学阐述，通过细菌 细胞表面多糖的标签来表明。结果与讨论含细菌多糖的岩藻糖作为一个模型系统。含岩藻糖的大肠杆菌086 O-抗原，它 的结构已被我们小组破解了9,成为一个模型系统。为了证明我们的战略，我们选 择引进岩藻糖类似物进入这个多糖。岩藻糖是一种常见组成细菌多糖的单糖。它是 细菌所导致的免疫反应性的主要决定因素。有两条通路中能自然产宓DP-岩藻糖， 这种多糖核苷酸将岩藻糖经岩藻糖转移催化结合后转换为寡糖，糖和糖缀化合物。（图1B）。一个所谓的从头合成途径讲的是
6、，GDP-岩藻糖是GDP-甘露糖通过GDP- 甘露糖生成脱水酶GMD）和GDP-岩藻糖合成酶CL）合成的。另一个是补救合成 途径，其中岩藻糖首先由墨角藻糖激酶磷酸化，然后通SDP-岩藻糖焦磷酸化酶转 化为GDP-岩藻糖。从头合成途径存在于原核生物和真核生物中，而补救途径最初认 为是只存在于真核细胞中。近日，康斯托克组确定的第一个也是迄今为止从人类 共生有机体拟杆菌知道的唯一微生物DP-岩藻糖补救途径。受到这个结果和最近对 将非自然糖类的代谢纳入哺乳动物聚糖的研究里，我们用拟杆菌补救合成途径代替 了大肠杆菌GDP-岩藻糖从头合成途径，我们能够将岩藻糖类似物以高效率和更准确 的引入多糖。（图2A）
7、用补救途径的功能代替GDP-岩藻糖从头合成途径的功能。为了证明成功地纳入 功能补救途径，我们打乱了在大肠杆菌86： B7中的从头合成途径，通过用像参考 文献描述的CAT基因来替换GMD-FCL基因序列m。从细胞表面脂多糖突变体与与野 生型菌株进行分离和可视化银染色研。野生型菌株产生的阶梯状光脂多糖。（图S1， 泳道1）gmd-fcl突变体，然而，所显示的半粗糙突变体表型，在其中只有脂质 核心结构和单一重复单元表达因此，毁坏GDP-岩藻糖的从头合成途径会耗尽GDP- 岩藻糖。这可能会出现细胞无法产生一个完整的重复单元，结果导致多糖单元的破 坏。突变体产生平滑脂多糖表型的能力是通过减少重组质粒来实
8、现的。（图S1） 这个结果表明,GDP-岩藻糖从头合成途径是大肠杆菌）86:B7的唯一途径，这个途径 能产生GDP-岩藻糖并且含有合成岩藻多糖是必不可少的成分。紧接着，我们研究了 在 gmd-fcl突变体中补救途径功能性表达的可能性。通过补救途径从脆弱类杆菌 菌株NCTC9343克隆FKP基因。FKP编码双功能的酶具有墨角藻糖激酶和焦磷酸化酶 活性。该FKP在大肠杆菌BL21中（DE3）建立的pET15b表达载体。蛋白质经Ni2+ 亲和色谱法，以接近均一（图S2）纯化。含有ATP, GTP,岩藻糖和FKP在一个50UL 的容器中进行反应。GDP-岩藻通过TLC在反应混合物中识别,MS和毛细管电
9、泳（CE） 测定（图S3和S4A）。这个结果证实FKP的体外酶促功能能减少GDP-岩藻由岩藻 糖，ATP和GTP.接下来的重组质粒（pET15b-FKP）引入thegmd-FCL突变体对。当重 组发生楠菌株生长B培养基中含有岩藻糖，该LPS相似，为野生型（图S1，泳 道6）。然而，在单独的培养基中或在一种含葡萄糖，该半粗糙脂多糖型没有改变 （Fig.S1，lane5）。这些结果表明，补救途径可以起到更换从头合成途径中的大 肠杆菌O86： B7生成多糖中的外源岩藻糖。补救途径走向岩藻糖类似物体外和体内 的滥用。岩藻糖（化合物1，图2B）和图9的岩藻糖的类似物（化合物2-10，图2B） 与上面的修
10、改C-6位（见SI附录化合物的合成及表征）在该研究中同时使用。在 C-6位岩藻糖的修饰已被证明是哺乳动物的补救途径和岩藻糖基转移酶L4 15）。 含有岩藻糖或岩藻糖类似物的在总体积为0UL的容器中进行反应，并形成相应的 GDP-糖检测和量化CE检测（图S4）。化合物5和7与分别氨基甲基和1 -羟乙基 基团，没给予相应的国内生产总值糖峰的波长集264纳米），从而对产品转化无 信息获得然而，反应确实发生作为正在由验证观察国内生产总值糖形成在SI-MS 分析，并纳入多糖被证实:E-MS（见图S5和下面的讨论）。经证实滥交路径在体外 的方法，调查是否岩藻糖类似物可以被代谢成体内多糖Thegmd（FKP
11、）菌株在分 别补充有10种化合物的LB培养基中培养。这些化合物没有表现出毒性，然而， 这些LPS有较低的聚合度。12的重复单元）。这个观察可能反映了该 polymeriza-酶具有特异性。然而，就出现了岩藻糖类似物可用于工程化细菌与DP- 岩藻糖补救途径产生的多糖。标记LPS和细菌细胞表面具有选择SCHEMICA反应体外。许多化学官能团已被应用于生物化学。常见的包括叠氮，炔酮，胺和羟基硫。叠氮化物是最可行和多功能的一个，因为它的稳定性和适用性在选择性的化学缀合 的官能化的膦或生理条件下的炔烃在活细胞的应用,（5）。纳入多糖的叠氮基使用 化合物4可以因此利用化学反应17）进一步衍生体外。我们分离
12、RPS从大肠杆 菌O86： B7gmd-FCL （FKP）菌株培养在培养基中岩藻糖和分别为化合物，和执行的 Cu（I）催化的32环加成反应与荧光素共轭门控烷果ere的代理ll.The结果的反 应表明，荧光容易地在大肠杆菌386的改善LPS检测：B7gmd-整箱（FKP）与6 -叠 氮基-岩藻糖4输送，而没有荧光从大肠杆菌386看出，在改善LPS：B7gmd-整箱（FKP） 与供给岩藻糖（Fig5A）。用的各种控制（图&8）的比较，表明该反应是高度特异 的。通过代谢途径工程获得的官能化的多糖也通过化学反应提供了可能的直接的细 胞表面标签。两个不同功能化多糖与氨基（化合物），分别被用作例子展示细胞
13、 表面标记。代谢改造以对细胞表面多糖的氨基可与生物素化的磺基琥珀酰亚胺活化 的球面度（化合物12）在PBS缓冲液中反应，形成稳定的酰胺ONDS。生物素包被的 细菌细胞可以通过以下方式探测结论用FITC标记的链霉亲和，导致荧光信号可以通过流式细胞术进行分析如该图 所示。5B，大肠杆菌O86： B7gmd-FCL与化合物5 （FKP）细胞与对照样品相比，表 现出显著增加荧光强度。其中一个控件，细胞岩藻糖和FITC染色一个没有任何体外 治疗相比较呈增加荧光信号的趋势。可能的解释是，在这两拂S的核心结构蛋白 和膜蛋白的氨基可以与磺基NHS生物素缀合反应，得到阳性荧光信号。然而，细胞 表达叠氮基中显示优
14、异的标记效率和特异性，具有极低的背景荧光（图）。这些 结果表明，叠氮基团不是更适合于特定的细胞表面标记。在这项研究中，我们展示 了一个一般的，浅显的和有效的方法，介绍修改纳入体内多糖的关键，这种方法的 成功在于2点：（i）该补救途径的从头合成途径生产将DP-岩藻糖的功能对等；（ii）补救途径中代谢非自然的岩藻糖衍生物，以产生补救途径中的突变菌株耗尽 的从头合成途径中的相应糖核苷酸。该功能表达的已经允许细胞直接从打捞的外源 性糖合成糖核苷酸的培养基中。因此，转化的补救途径中一般保存在糖类似物的修 改中。此外，由于只有天然从头合成途径被破坏，天然的糖底物的产生被有效地耗 尽。在这种情况下，细胞表面
15、多糖的表达仅仅依赖于通过补救途径产生的糖核苷酸。 因此，多糖高度的修改可以是实现的。他们为体外化学多糖的标签和细菌细胞表面 有用句柄。此标记技术在细菌细胞成像，前体药物共轭和定向给药的潜在应用。在 我们的研究中，即使证明原理实验已被证明与岩藻糖类似物，在原则上，这种策略可以应用到其他单糖组分，如半乳糖OAL），N-乙酰胺（GalNAc），N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和唾液酸神经氨酸Neu5Ac）的研究正在开展了在我们的实验室证明细 菌多糖的工程有不同的单糖类似物。参考文献1 Westphal O, Jann K, Himmelspach K (1983) Chemistry and immu
16、nochemistr y of bacterial lipopolysaccharides as cell wall antigens and endotoxins. Prog Allergy 33:9-39.2 JonesC(2005)VaccinesbasedonthecellsurfacecarbohydratesofpathogenicbacterAa. n Acad Bras Cienc 77:293-324.3 Ostash B, Walker S (2005) Bacterial transglycosylaseinhibitors. Curr Opin C hem Biol 9:459-466.4 WangL,XieJ,SchultzPG(2006)Expandingthegeneticcode.AnnuRevBiophysBiomol Struct 35:225-249. 5 Pr
