《RNA的变性电泳原理.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《RNA的变性电泳原理.doc（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、RNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理 RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%-1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电
2、泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。RNA非变性琼脂糖凝胶检测实验材料、器具及药品 蘑菇的总RNA溶液。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5g/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。 实验步骤 （1）用1TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。（2）在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4 ul于封口膜上。在实验台上再加入5 ul 1TAE电泳缓冲液及1 ul 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。（3）打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极
3、电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。 非变性电泳：上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液时间太长，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。使用 2ug 上样量，电压小于 6V/cm，使用新鲜的电泳缓冲液并且频繁混匀两极的缓冲液，是获得好的电泳结果的前提。(以 DNA 标准为参照，28S 和 18S 分别位于 2.0kb 和 0.9kb 左右。) 变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些。另外的可能是甲醛的质量不高。RNA的变性琼脂糖凝胶检测试剂： （1
4、） MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS）(PH7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。 （2）上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。 （3）甲醛。（4）去离子甲酰胺。电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）水冲洗乙醇干燥3%H2O2灌满室温放置10分钟0.1%DEPC水冲洗。操作： （1） 将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。 （2） 配制琼脂糖凝胶。 称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。 待胶凉至60-70 ，依次向
5、其中加入9ml甲醛、5ml 10X MOPS缓冲液和0.5 ul溴化乙锭，混合均匀。 灌制琼脂糖凝胶。 （3） 样品准备： 取DEPC处理过的500 ul小离心管，依次加入如下试剂： 10x MOPS缓冲液2ul，甲醛3.5 ul,甲酰胺（去离子）10 ul，RNA 样品4.5 ul,混匀。 将离心管置于60水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。 向管中加入3 ul上样染料，混匀。（4）上样。 （5）电泳：电泳槽内加入1XMOPS缓冲液，于7.5V/ml 的电压下电泳。 （6）电泳结束后，在紫外灯下检查结果。 RNA提取、电泳注意事项，有几点说得很好啊 快速的操作，低温环境，少量取上清主要是抽提之
6、后吸取上清时要特别小心，只要不把蛋白层吸出来就不会有RNase污染。分子克隆第二版343页,上关于提取RNA所用的玻璃容器的处理方法,是用前180度干烤8小时或更长时间;另一种方法是0.1%的depc水浸泡(37度2小时),然后灭菌水淋洗数次,100度干烤15分钟,然后高压灭菌除去depc.我们实验室一直是用170度考4小时,且不准离人,不准过夜,可能是怕 烤箱长时间高温,线路老化会发生危险吧 提取RNA所用的枪头，EP管。直接高压烘干即可。如果用0.1DEPC处理，要在DEPC配置后振摇1小时后再浸泡枪头，EP管方有效。我做的都是将枪头泡在配制好的depc中，摇振过夜，然后倒掉depc注意要
7、到干净，再高压，为了防止仍残留液体可120度干烤一会A.对于提取RNA来说,我认为关键的一点在于实验器材的准备.包括从最初的标本的制备,保存,以及之后的试剂的准备,匀浆器,镊子,tip头的去除RNase处理,尤其是去除RNase的DEPC处理步骤B. 您在处死大鼠前,先准备好干净的冻存管(用1.5ml的Ep管也可以,就是后面您在从液氮中取出的时候容易爆,您的注意安全),然后将去除的骨骼肌立即用 干净的剪刀分成半颗到一颗黄豆大小,装入冻存管后立即投入液氮保存.个人认为在这里使用装标本的管子没必要用DEPC处理C.在提取RNA之前,将试剂(TRIzol)和器械(tip头,镊子,匀浆器)都准备好D.
8、从液氮取出标本后,立即转移进入事先加入TRIzol的匀浆器内(最好置冰上操作),立即匀浆,一直到标本完全碾磨碎,这个时候TRIzol液体成浑浊状,而且匀浆器的壁上没有太多的黏附组织,然后将TRIzol转出,继续后续的步骤.1 RNase是一种蛋白酶，能够降解RNA。2我们的手上皮肤上有很多，应该是对我们的身体起保护作用。保护不被RNA病毒感染？或者什么的。3 这个酶高效稳定。要么在DEPC水中处理n小时，要么在160度高温烘烤6小时。此酶才会失效。4 所谓DEPC，是一种叫做焦碳酸二乙酯的东西。有毒啊。所谓DEPC水，一般指两种状态，a，配制好未消毒；b，配制好已消毒。通过高压消毒，该物质会降
9、解，从而无毒。1 无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯（DEPC），室温搅拌4小时以上至完全溶解，高压灭菌20分钟，冷却备用。这个是DEPC水的b状态。2 如果你要用DEPC水处理Tips等等东东，那么就要用高压前的水，即DEPC水的a状态。把枪头管子等完全浸泡至少8小时，我一般都是过夜的，或者平时就泡在里面备用。RNA 提取必须创造无RNase的环境，所有仪器与试剂均按照以下方法进行处理 ：研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等需在180烘干4h以上； 电泳槽、胶板、梳子、用0.1 %0.2%DEPC水处理过夜或者用洗涤灵清洗干净后用0.5%的SDS (Sodium dodecyl sulf
10、ate，抑制RNase的活性)浸泡过夜，然后用ddH2O冲洗干净，晾干备用；离心管，枪头等塑料器皿要用0.1%0.2%DEPC水处理之 后(DEPC有致癌之嫌，须小心操作)。37保温12h以上，然后高压灭菌，灭活DEPC ( Diethypyrocarbonate )；溶液都需用经DEPC处理过的水配置， RNA提取的所有操作应尽可能在超净工作台上进行。 我们研究所里提RNA用的枪头和EP管都是高压两遍的，没有用DEPC水处理。1、 有灭菌过的DEPC水，这一般是用来配75%乙醇用，因为乙醇若高压灭菌会挥发，所以乙醇是新开封专用的。2、 没有经高压灭菌的DEPC水，这主要是用于配你提RNA所用
11、的其他试剂（所说的试剂是可以经高压灭菌的），总的来说，都得经过高压灭菌，目的就是要去除DEPC，以防止它以随后实验的干扰。3、 DEPC处理水：无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯（DEPC），室温搅拌4小时以上，121 度高压灭菌20分钟，冷却备用。 凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至 0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸
12、15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用 DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂. 为啥在28s之后还是有影影约约的片断？和模糊的smear？这都与非变性电泳方式有关。RNA的电泳，严格讲是要使用变性电泳的，我们平时所知道的 RNA 电泳的知识，实际上都是由变性电泳获得的。但因为非变性电泳实在是太方便了，同时，就一般检测而言，完全可以替代变性电泳，所以我们日常检测就都使用非变性电泳了。电
13、泳时间太长了容易产生降解。最好是在120V左右。操作的时候有没有注意戴口罩和手套，注意，手套要经常换，不要太节约了。那样也会影响RNA的质量。无论你是提什么RNA只要是用异丙醇沉淀的，都得用75的酒精洗涤一次。1 样品不要太多，抽提务必充分，室温放置5min；2 200ul氯仿 剧烈振荡20s，室温放置215min；3 13000g 离心 15min;4 取上层水相,一般400-450ul就足够了，千万不要贪多！*5 加入500ul异丙醇 摇匀，室温放置10min； 6 12000g 离心 10min；7 75乙醇 1000ul 洗涤沉淀；8 7500g 离心 5min；（12000转速太高了
14、吧，沉淀不容易溶解的）9 弃乙醇，吸干净残余的微量乙醇， 室温干燥35min；（时间太久沉淀不易溶解）10 适量DEPC水溶解沉淀。电泳的上样量1ug，电泳buffer用DEPC处理的水配制，电泳时间不要太久，95V，1015min足够了。建议跑RNA电泳。先用2琼脂糖胶，若分离效果不好，可用甲醛变性胶。在上样缓冲液中注意加入RNA酶抑制剂。注意观察带形，质量较好的RNA亮度 。28S:18S应为2:1。还要注意观察，在加样孔或刚出加样孔附近，有没有带， 若有，可能为基因组DNA污染。 OD值只有1.5，可能为基因组DNA污染。参考一下分子克隆3。上面有OD值与污染DNA的关系。建议，酚氯仿抽
15、提后，上清可少吸一些。提取后的RNA样品可用无RNA酶的DNA酶消化一下。注意该酶的buffer中有一种物质在 OD260有吸光度，应严格按照其protocol操作，减少误差。 只要用DEPC处理过的水，打开一瓶新的无水乙醇（或者专用于RNA的， 即只用处理过的枪头取过乙醇的）配就可以了。DEPC高温高压时变成CO2和水，再加上乙醇也很容易气化，可能是因为有气体产生吧，如果盖子太紧容易发生瓶子破掉的事情。（我还从来没有听说过把乙醇高温灭菌过）而且，湿热灭菌本身不足以去除RNA酶，所以我觉得有时候，灭菌可能反而引入RNA酶污染也不一 定哦 75%的乙醇用于提取RNA 时最好还是现用现配，乙醇最好是新的且以后不要用于其他方面，也就是留一瓶专门用于提取RNA。DEPC一般高压灭菌30分钟就可以了！75%乙醇：灭菌后的千分之一DEPC水25ml 75ml无水乙醇.配好后装入高温烘烤的玻璃瓶中（160干烘四小时），或塑料器皿的用千分之一的DEPC泡12小时以上再灭30分钟，存放于低温冰箱4度保存!实验十一 动物组织细胞总RNA的提取一、实验原理RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA
