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1、菇类的栽培与发酵技术食药用菇类菌种保存法前言菇类菌种是农业上重要的生产菌，世界各菌种中心莫不把菇类菌种列为保存的重点之一，如美国菌种保存中心(ATCC)、英国国家微生物研究中心(CMI)、荷兰真菌保存中心(CBS)、日本大阪酦酵研究所(IFO)、美国农部北区研究中心(NRRL)等皆保存有相当数量的菇类菌种。在农业、制药及发酵工业上，环保菌株、生产菌株、接种源及分析用菌种之保存，均是非常重要的事，尤其是可信赖的优良母株，对于微生物利用工业而言，是绝对必要的，故保存微生物的方法很早就受到相当的重视(Martin, 1964)。不管是农业、医学、工业、食品等所使用的微生物，不仅要鉴定完善，而且必须在
2、接种过程中，维持菌株特性之安定，如以惯用之定期继代接种方法，在保存和制造种源时，其遗传上的安定性较难控制(Lincoln, 1960)，所以必须有一种稳定的保存方法，才能确保优良菌种的遗传特性。由于菇类菌种的细胞核分裂速度快，且易受环境改变的影响，自然突变的机率大，若未能适当保存，常会发生退化及变异现象而失去其原有之优良特性而降低其生产量及质量，造成栽培者重大损失及食品市场来源不稳定之困扰。民间常用的矿物油保存虽可短时间保存菌种，具有防止污染及避免干燥之优点，然其稳定性差，一旦宝贵的菌种发生突变或死亡，所造成的损失将无可弥补，所以必须有一套完善的保存制度方是长久之计，任何先进国家成立菌种保存中
3、心之理由亦是在此。因之，如何保存其遗传之稳定性实为重要之课题。导致基因重组和突变的有丝分裂，与细胞的分裂及代谢活力有关，一个理想的基因种原保存是应在代谢被不活化的状态下，将活的菌体控制维持其活性，亦即制止其细胞的分裂与停滞其生长 (Jong and Davis, 1987)，此一目标已用超低温保存方法发展成功，并为长期保存食用菌类的最好方法 (Jong, 1978 & 1987)。在诸多的冷冻剂中，如液态空气、氢、氦及氮中，以液态氮被认为是最安全及最符经济效益的 (Jong, 1987)，然在超低温冻化过程中，由于水分的传送均经过细胞膜，冷冻时细胞内冰晶的形成刺伤胞膜与胞内溶质浓度增高，容易导
4、致冻害。控制适度降温速率可提高细胞存活率，为能降低在冻结及解冻时所发生的冰晶伤害程度，采用适当的化学保护剂，可以减少冰晶的形成。目前已有很多的化学化合物曾被单独或混合使用为冷冻保存菌种的抗冻剂，这些抗冻剂能控制冰晶的大小及形成速率，能缓和溶质的浓度的急速增高及增加细胞膜的水渗透性，并降低细胞内容物的凝结点，以利冷冻时细胞脱水的进行。抗冻剂有两大类型，一为浸入型，如甘油及DMSO等，此等溶液能渗入细胞内，而得以胞内及胞外同时发挥其保护效果；二为非浸入型，如糖类及PVP等，用于使胞内胞内于冷冻时与水分子产生结构上的改变与细胞内溶质浓度的平衡，避免脱水过度。冷冻干燥法是优良的菌种保存方法，能够维持菌
5、种的稳定性，通常适用于细菌、酵母菌及能产生孢子的霉菌，但对于只有菌而不会产孢的霉菌及菇类真菌而言是不能适用的，因此冻干法对于菇类真菌来讲是有限制的。由于精液及血液能成功地保存于液态氮中，启发了真菌或许也能利用此一方法来保存的构想。由于此种超低温保存法能减少细胞内外的液态水而使许多生理作用不能进行，并能防止细胞核的分裂，使细胞发生变异之可能性降低最低，故对菌种中心及相关研究是最重要的方法。菇类之研究领域现已逐渐成为世界各国研究发展为高经济科技及学术探讨之对象，故无论在采集、鉴定、分离、复核、栽培、形态、生理生化分类及长期保存菌种上皆具重要性。菇类在分类上是属于担子菌及子囊菌之高等真菌，在农业、医
6、学、工业等研究范畴中具有相当重要的地位及研究潜力，但是若无法妥善保存菌种，则将导致菌体的变异或退化，使其失去其原有优异的遗传特性，或降低活性甚至死亡，均将严重影响其经济效益及研究价值，故知长时间保存菌种时应采取适当之措施以防止变异发生。因此，菌种保存工作在科学发展领域上扮演着举足轻重的角色。菇类自古与中国人之食性有密切之关系，例如香菇、洋菇、草菇、木耳等至今仍为我国甚至于全世界各国人民所喜爱的食品。就保存与销售方面而言，菇类因属真菌，在培养基上采菌丝培养是最直接简便之方法，不过因菌体在培养基上极少产生孢子，不适用于冷冻干燥法长期保存菌种。若是收集子实体之担孢子或子囊孢子，虽可利用冷冻干燥法保存
7、，然因子实体产生之孢子在采收时已曝露在空气中，尤以野生采集为然，极易受到污染，故在活化接种时必须采用单孢分离，而且必须正负两个品系交配，所以虽然能确保长久保存的成功率，但因操作繁琐，只有少数学者研究某特定之属，且为了杂交育种之便才被采用，以菌种保存中心而言，此法难以被采用。理想之基因种源保存是制止细胞分裂及停滞其生长使其生理代谢完全停止活动。由于食用菇类绝大多数系以纯菌丝生长，在培养基上极少产生孢子。所以，除了能形成节孢子或芽孢子之菌株外，均不适用于冻干保存。近二十年来已成功地使用超低温保存法长期保存食用菌类菌种(Jong, 1987; Jong & Davis, 1987)。其中液氮保存系利
8、用液氮液相( -196)及其气相(-150180)的超低温，使细胞内外的液态水减少而无法进行生理作用，同时抑制细胞核分裂，防止其变异。而细胞在冷冻解冻的过程中，常因温度超过-139时所形成的冰晶对细胞造成伤害，以致于影响其存活率。因此需配合冷冻解冻速率之控制及保护剂之添加，以减少细胞在液氮保存过程中损伤。目前已知以 1 /min 的速率缓慢降温冷冻(Hwang, 1966)及以3740快速解冻法(Jong, 1987)，并以10%甘油或5%DMSO作为抗冻剂(Jong, 1987; Jong & Davis, 1987)对大部份菇类保护效果较佳，因此液态氮咸认是最好及最安定之长期保存食用菌之方
9、法(Goos, 1967; Miler and Jong, 1987; Smith and Onions, 1983)。由于使用冷冻干燥法保存菇类菌种仍有困难，如欲有效地保存菌种原有之基因型及表现型之遗传稳定性，则只能采用超低温保存法保存之。经研究绝大部份之菇类能以小米粒为生长基质，10%甘油作为抗冻剂，经 1 /min 降温速率保存在-80冰柜及液态氮中，可维持相当高之存活率 (陈, 1988 & 1989.)。一般抗冻剂以10%甘油即可以避免冰晶的形成造成细胞之伤害，但是甘油渗透速度慢，须静置一段时间才能完全渗入，而渗透过久对某些菌会造成毒害（Smith & Onions, 1983）。例
10、如草菇在甘油中保存在4三周后，其存活率及生长速率普遍降低，即可能为甘油对草菇菌体造成毒害之结果。而 5% DMSO是相当好之抗冻剂而且渗透速度快，唯DMSO对人体毒性较大，所以较少为学者所采用，但许多菌种仍需靠此一抗冻剂来保存菌株且存活率优于甘油（Hwang, 1968; Smith & Onions, 1983）。控制冷冻之降温速率能使细胞外溶液冻结而细胞内不冻结（Pegg, 1976），由于扩散的原理而导致细胞逐渐脱水至细胞外结冰，以防止冰晶对细胞造成膜的破裂，形态的改变、抑制 RNA, DNA 的合成等等伤害（Calcott, 1985）。细胞质的冰点 (freezing point)
11、常大于-1，而且有超冷的现象(supercooled)，即使细胞外的液体已结冰，而细胞内尚末冻结，此现象显示细胞膜可防止外部冰晶进入超冷的内部，亦即细胞内不含有超冷的冰核 (Mazur, 1970)。然降温速度若过于缓慢，则会因严重失水造成胞内毒害，但降温速度若太快易使得细胞内结冰而刺伤细胞（Pegg, 1976; Pegg & Shell, 1984），而直接置入 -80 及液态氮中保存，由于降温速度太快阻碍保存之效果（Jong, 1987）。快速解冻可以减少解冻过程中冰晶的再形成对菌体造成伤害，故以37-45快速解冻可以减少解冻过程冰晶之再形成，提高存活率（Goos, 1967）。食用菇类
12、多数具有丰富之营养价值，其所含之蛋白质、氨基酸、维生素及矿物质之含量与种类均较一般蔬菜为高为多。彼等之栽培较容易，能利用富有纤维素之农业废料如谷类禾秆，锯木厂之木屑废弃物来生产，而栽培后之废弃培养基质，又可当做饲料、肥料或供抽取酵素及特殊成分之用，利用价值甚高，因此广泛搜集菇类菌株，对今后台湾新兴菇的发展及其新产品之开拓，当极有帮助，菌种中心成立的目的亦即除保存本土特有菌种之外，同时提供国内外各类食药用菇菌种供国内业者及学者采用。保存方法菇类菌种保存方法，大致上可分为五种：继代培养法、液体石腊覆盖法、无菌水保存法、冷冻干燥法、低温保存法(表一)，其中继代培养方法是一般人常用的方法，虽操作简便，
13、但容易产生变异而影响其原有的优良品种；经过灭菌的液体石腊覆盖在菌种上面，可阻隔空气的水分散失，减缓空气的进出，但菌体代谢仍照常进行，遗传稳定性仍差；将菌体悬浮在无菌水上面，在冰箱冷藏可短时间保存菌种，这是较适合一般菇农实施的方法，唯同一菌株应以保存时间不超过半年为限，否则变异仍将逐年明显；冷冻干燥保存方法是一种不会产生变异的方法之一，一般仅适用于产孢的霉菌而言，对于其它菇类菌种，则目前荷兰真菌保存中心(CBS)已初步试验成功 (Tan & Stalpers, 1991)，利用双糖之trehalose为保护剂，对裂褶菌 (Schizophyllum commune) 及鬼伞 (Coprinus
14、psychromorbidus) 冷冻干燥后可以存活，但还不稳定，此方法仍有待更多的实验，不过若能成功的话，则将使销售及运输达到相当的便利程度。低温保存法可分为两种，一为 -20至 -135之间的保存，另一种为超低温液态氮保存【温度介于 -150(气相)至 -190(液相)之间】，-20至-135之间的保存是靠冰箱冷冻保存，选择适当的抗冻剂可保存两三年，但由于冰箱会受到停电、机器的稳定性及开开关关温度变化大等因素，使菌种容易受到外在因子的影响而导致死亡，因此必须时常测试其存活；而液态氮保存，不管是液相或气相，温度均低于-139，完全不受电力影响，是目前被公认世界上最佳的保存方法。食品工业发展研
15、究所所有菇类菌种皆保存于液态氮中，除极少数比较敏感的菌株之外，其余皆可妥善保存 (陈, 1988, 1989)，例如木生菇中之香菇、金针菇、鲍鱼菇、木耳、灵芝、伏苓等菌种保存在-80及液态氮时，以10%甘油、10%葡萄糖、10%蔗糖及无菌水当抗冻剂时，在10%甘油中能维持相当高的存活率；而草性菇中之洋菇及草菇于-80及液态氮保存，以不同抗冻剂保护，除草菇保存较差之外，不同品系的洋菇在保存上皆没有问题(王, 1989)，而利用此种超低温保存与传统之继代培养方式对菌种菇体形成前菌丝生长期日数长短有显著的影响，而且若经人工栽培试验比较其产量时，也很明显可以看出液态氮保存的菌种有较高的产量。一、继代培
16、养法、选择适当培养基，制成斜面试管，将菌种移植生长。、每一菌种最好有五至十根试管培养。、每次更新培养基时，最好以适当培养基及营养条件差的培养基轮流替换，以减少因长期生长在营养成分高的培养基造成突变率增高或生理活性降低。例如夏季鲍鱼菇可培养于马铃薯葡萄糖洋菜培养基(PDA) 及麦芽糖抽出物培养基(MEA) 或单纯洋菜培养基(WA)。、随时留意贮放期间是否受到污染，棉花塞试管应避免瞒的侵袭造成污染，若为螺旋试管，则应留意管口是否因湿气而有杂菌滋生。、若发现有老化、退化、污染等情形，应舍弃重新购入菌种，以免因污染或菌种活性退化而产量降低造成损失。二、液体石腊覆盖法、选择营养成份较低的培养基（但也必须菌株能生长良好的培养基），将菌种移植生长，直到长满试管。、将已杀过菌的液体石腊油倒入试管内，拴上螺旋盖子或塞入棉花塞。、于室温中或4
