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1、泌尿系感染产超广谱内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌的耐药表型和基因分型【关键词】 大肠埃希菌Resistant phenotype and genotype of extended spectrum lactamase (ESBLs) produced in Escherichia coli isolated from urinary infectionsGENG Yan1, ZHANG WangGang1, WANG XiangLing1, YANG HuiBin2, HUANG Fang1, ZHANG Yi11Department of Clinical Laboratory, Seco
2、nd Hospital, Xian Jiaotong University, Xian 710004, China, 2Department of Transportation Management of Xian City, Xian 710065, China【Abstract】 AIM: To study the resistant phenotype and genotype of extended spectrum lactamase (ESBLs) produced in Escherichia coli isolated from urinary infections. METH
3、ODS: Organisms of clinical infection were identified by automatic microbial system (Vitek) and the bacterial susceptibility was tested by KirbyBauer (KB) method as described in NCCLS. ESBLs was detected by disk diffusion confirmatory test and CTXM or SHV specific PCR were used to determine the genot
4、ype of ESBLs. RESULTS: 24.0% of E.coli produced ESBLs. Fortytwo of the 62 ESBLs producing strains (67.7%) expressed CTXM lactamase and 9 of the 62 ESBLs producing strains (14.5%) expressed SHV lactamase. CONCLUSION: ESBLs producers are mainly resistant to cefotaxime and cefiriaxone and most of them
5、are multidrug resistant. Cefotaxime resistance is partially due to the production of CTXM lactmase. CTXM lactmase is most prevalent.【Keywords】 Escherichia coli; extended spectrum lactamase; phenotype, antibiotics resistant; genotype【摘要】 目的:了解本地区泌尿系感染产超广谱内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌耐药表型及其基因型分布. 方法：收集200303/20040
6、6间临床分离的尿培养阳性大肠埃希菌共258株, ESBLs的检测采用NCCLs规定的ESBLs型筛选和确定实验，用KB琼脂扩散法进行药物敏感性检测，并应用聚合酶链反应（PCR）方法对所分离的产ESBLs菌株进行SHV, CTXM基因型检测. 结果：产ESBLs大肠埃希菌检出率为24.0%(62株），67.7%(42株)携带CTXM基因，14.5%(9株) 的菌株携带SHV型基因，并有1.6%(1株)同时携带CTXM基因和SHV型基因. 结论：本地区泌尿系感染产ESBLs大肠埃希菌以耐头孢曲松和头孢噻肟为主; CTXM型的ESBLs最为常见.【关键词】 大肠埃希菌；超广谱内酰胺酶；表型,耐药；基
7、因分型0引言内酰胺类抗生素是临床抗感染治疗中使用最广的一类抗菌药物，产内酰胺酶是细菌对此类抗菌药物耐药的主要机制，由质粒介导的超广谱内酰胺酶（ESBLs）是导致革兰氏阴性杆菌对内酰胺类抗生素耐药性的最重要机制，一旦这类酶由于某种机制而产生了大量由染色体或质粒介导的内酰胺酶（青霉素酶、头胞菌素酶、碳青酶烯类酶等），则可使包括第三代头胞菌素在内的许多内酰胺类抗生素失活，成为目前临床治疗感染性疾病的重大难题. 为了解本地区泌尿系感染产ESBLs大肠埃希菌耐药表型和基因型分布特征,我们对临床标本中所分离到产ESBLs大肠埃希菌进行分子生物学研究.1材料和方法1.1材料收集200303200406西安交
8、通大学第二医院细菌室临床尿培养分离的大肠埃希菌共258株. 培养基:MuellerHinton琼脂，羊血营养琼脂购自上海医化所，ESBLs的阳性质控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603. 药敏实验质控菌株：大肠埃希菌E.coli ATCC25922. 药敏纸片：阿米卡星(AN)、复方磺胺 (SXT)、呋喃妥因（F）、环丙沙星(CIP)、左旋氧氟沙星（LEV）、头孢唑啉（KZ）、头孢呋新（CXM）、头孢噻肟(CTX)、头孢曲松（CRO）、头孢他啶(CAZ)、氨曲南(ATM)、头孢西丁(FOX)、头孢吡肟(FEP)、亚胺培南(IMP)、头孢哌酮舒巴坦（SCF）、替卡西林克拉维酸(TIM)、哌拉西林
9、 三唑巴坦(TZP) 、头孢他啶 克拉维酸(CD02)、头孢噻肟 克拉维酸(CD03)，纸片为英国OXOID公司产品. 每周用质控菌株进行质量控制.1.2方法1.2.1ESBLs的检测采用全自动微生物分析仪Vitek GNI+卡对所分离菌株进行鉴定. 抗生素敏感性试验采用纸片扩散法即KB法，大肠埃希氏菌ATCC25922做药敏质控. 药敏结果按NCCLS标准进行判定（S, I, R）. 按1999年NCCLS100S10推荐的方法进行超广谱内酰胺酶ESBLs的检测和判定，采用纸片扩散法，包括筛选和确认实验两步. 选用头孢他啶、头孢噻肟两种药敏纸片（30 g/片），凡头孢他啶22 mm、头孢噻肟
10、27 mm，均应进一步作确认. 当头孢他啶（30 g/片）与头孢他啶/棒酸（30 g/10 g）或头孢噻肟（30 g/片）与头孢噻肟/棒酸（30 g/10 g）中任意一组药物的抑菌环直径相差5 mm，可确认为ESBLs阳性菌株. ESBLs的质控菌株大肠埃希菌ATCC25922（头胞他啶与头胞他啶+克拉维酸相差2 mm）肺炎克雷伯菌ATCC 700603（头胞他啶与头胞他啶+克拉维酸相差5 mm）.1.2.2PCR试验取单个菌落接种于5 mL LB肉汤，37振荡培养20 h. 取1.5 mL菌悬液在4以650 g离心5 min，弃上清. 加入500 L的无菌去离子水，振荡混悬. 95水浴加热1
11、0 min，4 650 g离心5 min，上清即为制备的模板DNA. 在Genbank里利用Primer3.0设计引物. 引物序列为：左侧引物5CGCCTGTGTATTATCTCCCTGT3，右侧引物5TTAGCGTTGCCAGTGCTC3. CTXM型酶引物序列为：左侧引物5AAAAATCACTGCGTCAGTTCA3，右侧引物5TTACAAACCGTTGGTGACGA3. 引物由上海生工生物技术有限公司合成. PCR反应总体积为50 L，其中10Buffer为5 L；dNTP混合物，各组分0.2 mmol/L；Taq酶2 U；左右侧引物各0.5 mol/L；MgCl2浓度为2.0 mol/
12、L；模板2 L. 在加入Taq酶前，首先在95预变性10 min. PCR循环条件为93变性1 min，55退火1 min，72延伸1 min，共30循环. 琼脂糖电泳：在电压为4 V/cm2条件下电泳35 min，紫外灯下观察结果，并用凝胶成像系统照像.统计学处理: 应用SPSS 11.0软件进行统计学分析（包括Fisher精确概率法、2检验）. P0.05认为差异有统计学意义.2结果泌尿系感染产ESBLs大肠埃希菌的分离率在门诊和住院有差异（P0.05, Tab 1）. 泌尿系感染大肠埃希菌产ESBLs与ESBLs阴性菌的耐药性（Tab 2）：ESBLs阳性与ESBLs阴性的大肠埃希菌两者
13、的耐药率（包含中介）差异有统计学意义(P0.05). 62株产ESBLs大肠埃希菌的分子生物学初步分型结果显示：67.7%(42株)携带CTXM基因，14.5%(9株) 的菌株携带SHV型基因，并有1.6%(1株)同时携带CTXM基因和SHV型基因. 研究提示本地区泌尿系感染产ESBLs大肠埃希菌的主要基因型为CTXM基因，同一菌株可能同时携带多种质粒介导的ESBLs，导致其耐药基因的复杂性.表1表2(略)3讨论自从1983年在德国从臭鼻克雷伯杆菌中分离出SHV2型ESBLs以来，大量的新型ESBLs从不同的细菌、不同的国家和地区分离出来，导致ESBLs在地区间的分布呈现明显的差异性1,在西安
14、地区泌尿系感染患者尿培养的大肠埃希菌株中ESBLs的检出率达26.05%,与国内其他地区的平均水平相当2,3.文献报道ESBLs不能水解头霉素类，但本研究结果提示，对于产ESBls菌株头孢西丁仍有近40产生耐药，这可能与细菌细胞外膜的改变或细菌同时产生AmpC酶有关4-5. 尽管NCCLS明确指出对ESBLs，不管其体外药敏试验结果如何，都应被视为对所有头孢菌素类抗生素耐药6，头孢吡肟对于产ESBLs的抗菌活性文献报道不一，但由于头孢吡肟具有更强的细胞膜穿透性、对酶的低亲和性和对酶更强的稳定性等特点7，大部分认为其对高产AmpC酶菌株具有强大的抗菌活性8，但对同时携带ESBLs的阴沟肠杆菌应谨
15、慎应用.在体外药敏试验中,产ESBLs菌对氨基糖甙类、磺胺类和喹诺酮类抗生素的耐药亦相当严重，与国外报道相比9，产ESBLs菌对氟喹酮类抗生素的敏感性明显低，左旋氧氟沙星和环丙沙星耐药率超过60%，这与临床泌尿系感染更习惯选择氟喹酮类抗生素有关. 其原因可能由于产诱导酶的细菌通过DNA 转移酶变异和外膜蛋白通透性降低而导致对喹诺酮类抗菌药物耐药，同时这与产ESBLs菌株在携带有ESBLs的质粒上可同时携带有多个对氨基糖甙类、喹诺酮类和磺胺类等抗生素的耐药基因有关10.本研究中，对可疑菌株进行ESBLs表型确证试验，98株细菌为产ESBLs菌，其中仅表现为CD02抑菌圈直径比头孢他啶的增大值5
16、mm的菌株有8株，仅表现为CD03比头孢噻肟的抑菌圈直径增大值5 mm的有38株，两者同时具有的为16株. 说明本地区检测到的ESBLs的水解底物主要为头孢噻肟，头孢他啶在体外对产ESBLs菌的抗菌活性要比头孢噻肟强.根据ESBLs的同源性可分为TEM型、SHV型和CTXM型等. 其中前两型最多见，呈世界范围流行，其对头孢他啶的水解活性较强；而CTXM型酶对头孢噻肟具有高度水解活性，对头孢他啶的水解作用很小，其在南美、东欧和东亚地区比较流行11. 我国以CTXM型为主，本试验PCR结果也同时证明了这一点：在产ESBLs大肠埃希菌中，CTXM型检出率为67.7，SHV型检出率仅为7.69,因此，在西安地区产ESBLs菌中，CTXM型较为流行，这可能与本地区大量使用头孢噻肟和头孢曲松有一定的关系，说明西安地区同样面临着
