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1、岛津液相色谱仪注意事项1. 流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质（使用0.45um或更细的膜过滤）。2. 流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。3. 不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。4. 使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去含5%有机溶剂的去离子水冲洗 管路及柱子一小时，然后用甲醇（或甲醇水溶液）冲洗40分钟以上，以充分 洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以 上。5. 长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相（如甲醇等），因为纯水易长霉。6.
2、每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂去掉盐清洗进样器。7. C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。8. 堵塞导致压力太大，按预柱混合器中的过滤器管路过滤器-单向阀检查，并清洗。清洗方法；以异丙醇作溶剂冲洗：放在异丙醇中间用 超声波清洗；用10%稀硝酸清洗。9. 气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气 泡。10. 要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。11. 更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边清洗，然后插入 新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。高效液相色谱常见故障的断定及解决12. 流动相用前过滤，不在于过滤
3、多少遍，主要是看里面还有没有肉眼可见的小颗粒，常规做法，两手托瓶，将瓶朝一个方向旋转，在瓶底没有可见 颗粒的前提下，看瓶底，若有东西向下沉，表示里面有脏东西，需重新过 滤，否则就是流动相已过滤好。可能的原因及解决方法（一）保留时间变化1. 柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱2. 等度与梯度间未能充分平衡 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱3.缓冲液容量不够 用25mmol/L的缓冲液4. 柱污染每天冲洗柱5. 柱内条件变化稳定进样条件，调节流动相6. 柱快达到寿命采用保护柱（二）保留时间缩短1.流速增加检查泵，重新设定流速1=12. 样品超载降低样品量3. 键合相流失流动相PH值保持在37.5,
4、检查柱的方向4. 流动相组成变化一次不要配太多流动相，以免流动相放时间太久出现流动相蒸发或沉淀。5. 温度增加 柱恒温（三）保留时间延长 1流速下降管路泄漏，更换泵密封圈,排除泵内气泡2. 硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂，如加三乙胺，或采用碱至钝化柱3.键合相流失同前（二）34. 流动相组成变化同前（二）45. 温度降低同前（二）5（四）出现肩峰或分裂峰1. 样品体积过大用流动相配样，总的样品体积小于第一峰的15%2. 样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂3. 柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4. 柱内烧结不锈钢失效 更换烧结不锈钢,加在线过滤器，过滤样品5. 进样器损坏更换进样
5、器转子（五）鬼峰1. 进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀，改进阀和样品的清洗2样品中未知物 处理样品3. 柱未平衡重新平衡柱,用流动相作样品溶剂（尤其是离子对色谱） 4.三氟乙酸（TFA）氧化（肽谱）每天新配，用抗氧化剂 5.水污染（反相）通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水 （六）基线噪声1. 气泡（尖锐峰）流动相脱气，加柱后背压2. 污染（随机噪声）清洗柱，净化样品，用HPLC级试剂3. 检测器灯连续噪声更换氘灯或检测池脏4. 电干扰（偶然噪声）采用稳压电源，检查干扰的来源（如水浴等）5. 检测器中有气泡流动相脱气，加柱后背压（七）峰拖尾匹 1=11. 柱超载降低样品量,增加柱直径
6、采用较高容量的固定相2. 峰干扰 清洁样品，调整流动相匹1=13. 硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值，钝化样品4. 同前（四）4同前（四）45. 同前（四）3 5.同前（四）36. 死体积或柱外体积过大连接点降至最低，对所有连接点作合适调整，尽可 能采用细内径的连接管7. 柱效下降用较低腐蚀条件，更换柱,采用保护柱（八）峰展宽1. 进样体积过大同（四）12. 在进样阀中造成峰扩展 进样前后排出气泡以降低扩散3. 数据系统采样速率太慢 设定速率应是每峰大于10点4. 检测器时间常数过大 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%5.流动相粘度过高增加柱温,采用低粘
7、度流动相1=16. 检测池体积过大用小体积池，卸下热交换器1=7. 保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱8. 柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小9. 样品过载进小浓度小体积样品液相色谱柱使用经验谈色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后 评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动 相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱 柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是最佳条件），只有这样， 测得的结果才有可比性。1、样品的前处理:a、最好使用流动相溶解样品。b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生
8、不可逆吸附的 杂质。使用0.45叩的过滤膜过滤除去微粒杂质。2、流动相的配制：液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量 交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱 中（或长时间保留在柱中）。b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应（特殊情况除外）。c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的 分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命（可运用提高温 度的方法降低流动相的黏度）。d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器， 最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。e、流动相沸点不要太低，否
9、则容易产生气泡，导致实验无法进行。f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微 量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作 用。2、流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用 不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳 柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6皿的色谱柱，流速一般选择 1ml / min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml / min为佳。当选用最 佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法 以缩短分析时间（如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量）。a.注意:由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用
10、甲醇体系（必须使用乙腈的场合除外）。b.对于正相柱推荐使用沸程为30-60C的石油醚或提纯后的己烷作流 动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水（电阻率大于 18兆欧），去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。c, 含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流 动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。d, 流动相要求使用0.45凹滤膜过滤，除去微粒杂质。e.使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能柱的使用和维护注意事项（推荐） 色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿 命甚至损坏。在色谱操作过
11、程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱 柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动 柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过 缓（如前所述）。 .应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变 为全部是水，反之亦然 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以 反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可 以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流 动相在进入分析
12、柱之前预先被硅胶饱和，避免分析柱中的硅胶基质被溶 解。 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时， 对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体 积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要5075ml。下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或 庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶 剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新 活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略 最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去
13、残留的非极性杂质，在甲醇（乙睛） 冲洗时重复注射100200皿四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢 吠喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此 外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。阳离 子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去 交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的 有机物）、甲醇、水依次冲洗。 保存色谱柱时应将柱内充满乙睛或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥 发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。 色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这 时应更换滤片或将其
14、取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱1=1头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增 大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出1 2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿 润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理 后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部 分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（530mm），可以起到 保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通 常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在 pH29
15、范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质 保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加 填料使柱效恢复。每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后 应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、漠）的化合物可能会腐蚀不 锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔 45天开机冲洗15分钟。液相色谱管路接头故障解决方法 1、管路阻塞阻塞是管路的主要故障，管路完全阻塞，压力会突然升高，超压。部分 阻塞开始不明显，不断滞留在液流中的微粒压力会慢慢升高，最后完全阻 塞。管路阻塞同时会看到接头或垫圈渗漏，低压好一些，高压渗漏明显。管路完全或部分阻塞是由下列原因引起的: 没有很好过滤流动相； 样品中有微粒； 泵或进样器垫圈产生碎片; 预柱、护柱和分析柱中漏出填料; 毛刺和锉屑进入; 流动相中的结晶盐； 微生物 系统中进入了其它颗粒性物质。系统中管路阻塞的现象很少见，常见的是烧结过滤片（玻璃砂芯）阻 塞
