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1、基因工程的概念：主要是利用DNA重组技术，将生物的某个基因或一个DNA片段通过基 因载体（DNA载体）运送到另一生物的活性细胞中，然后经过克隆和行使正常功能:表达），从 而创造生物新品种或新物种的遗传学分子技术（从细菌到高等生物）。重组 DNA 技术的三大基本元件：供体、受体、载体上游、下游技术：上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建即重组DNA技术）； 而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。克隆的概念：从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所 组成的特殊的生命群体。分子克隆的概念：是指分离一个已知DNA序列，并以活体内方
2、式获得许多复制品的过程。细菌基因工程流程：（1）外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。（2）适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组；（3）外源基因的导入；（4）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选；（5）外源基因表达产物的生理功能的核实；内含子：内含子指真核生物基因中不能翻译成蛋白质的DNA片段，但可被转录，当两侧序 列（外显子）的转录RNA被剪接在一起时，就将内含子转录的RNA从整个转录物中除去。 外显子：外显子是指能够翻译成蛋白质的任一间断的基因片段，一个基因可有多个外显子。限制：细菌为防御外来DNA入侵而将其降解的现象。（一般由限制酶来
3、降解外源DNA） 修饰：细菌为防止自身DNA被降解而修饰自身DNA。（一般由甲基化酶进行修饰）限制性内切酶的概念：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切 割DNA双链结构的核苷酸内切酶。限制性内切酶的命名规则：按属名、种名、株名、编号来命名，若种名头2个字母相同，则 其中一个可用种名的第一和第三个字母。II型限制酶识别序列的特征：识别序列主要为4-6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列。但 有少数酶识别更长的序列或简并序列,切割位置因酶而异,有些是隔开的。识别回文对称结 构。切割位点大多数在内部，也有在外部的。切割所产生的末端的类型：匹配的黏末端、非对称突出末端、平末端同裂
4、酶：识别相同的序列的限制酶。同尾酶：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相 同的黏性突出末端。这些酶称为同尾酶。星活性的概念：是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割 非典型位点。大肠杆菌DNA聚合酶I的三种活性:(1) 57聚合酶活性；2)外切酶活性；外切酶活性Klenow大片段的活性：5 -3的聚合酶活，3 -5的核酸外切酶活性逆转录酶的活性：依赖于RNA的DNA聚合酶活性：可以有效地将mRNA反转录成DNA, 其产物称为 cDNA； RNase H 活性:水解 DNA-RNA 杂合链中的 RNA 分子；依赖于 DNA 的 DNA
5、 聚合酶活性。T4 DNA 连接酶的活性：可修复双链 DNA 上的单链缺口；连接 RNA-DNA 杂交双链上的 DNA链缺口或RNA链缺口；连接完全断开的两个平头末端DNA分子。碱性磷酸酶的活性：在用3P标记DNA 5端之前，去除5端的磷酸；在DNA重组 技术中，去除DNA片段的5磷酸，防止载体的自身环化，提高重组子比例。质粒的概念：是染色体外的遗传因子，能进行自我复制，多为超螺旋共价、闭合、环状双链 DNA,少数线状。质粒的构型： 当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA(cccDNA)，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整
6、的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时， 称之为开环 DNA (ocDNA)。若质粒DNA的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为L构型。a -互补的概念：指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区 段的 -半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。蓝白斑筛选的原理：将外源基因克隆在pUC18的lacZ标记基因内部，使之灭活，此时重 组子为Apr、lacZ-基因型，乳白色菌落；而非重组子则为Apr、lacZ+基因型的蓝色菌落。一个理想的载体应该具备哪些特性，入-噬菌体载体的类型。(1) 能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达；(2) 具
7、有多种限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源DNA片段插入其 中；(3) 具有容易检测的筛选标记；(4) 载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多 的拷贝；(5) 在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。 插入型载体、取代型载体黏粒的结构特征，酵母人工染色体的基本元件。黏粒含有质粒复制起点(ColE)、抗生素抗性标记基因(ampr)、cos位点，可像质粒一样转化和 增殖。黏粒大小一般为57 kb,可克隆大片段DNA,克隆的最大片段可达45 kb。酵母染色体的端粒序列、酵母染色体的复制子、酵母染色体的着丝粒序列 、酵母系统的选
8、择标记、大肠杆菌的复制子标记、YAC载体的装载量为250 - 400 kb大肠杆菌表达载体的基本元件：启动子、RBS、终止子、克隆位点、大肠杆菌复制起始位点、 标记基因启动子：是DNA中一段特定的核苷酸序列，这段核苷酸序列是RNA聚合酶在转录起始时 对模板DNA的识别部位和结合部位，是转录过程能否起始的决定部位，其本身不转录。一 般位于表达基因的上游。RBS：基因外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大 程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。mRNA翻译的起始效率主要由其5端的结构 序列所决定，称为核糖体结合位点(RBS)。SD序列：位于翻译起始密码子上游的6
9、-8个核苷酸序列5 UAAGGAGG 3，即SD序列。 终止子：基因的3端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶识别并停止转录的功能。tac、T7 启动子诱导表达的原理。启动子lac及其衍生启动子tac都是诱导型启动子，在IPTG的诱导下启动转录。T7噬菌体启动子只能由T7噬菌体的RNA聚合酶识别，大肠杆菌的RNA聚合酶无法识别。 将T7 RNA聚合酶基因(T7 gene 1)置于lacUV5启动子之后，构建 噬菌体，再将此噬菌体 整合到大肠杆菌基因组，得到大肠杆菌BL21(DE3)；将pET表达载体导入大肠杆菌后，因 为大肠杆菌的lacI基因产生阻遏蛋白，lacUV5启动子无法启动T7
10、RNA聚合酶转录，T7 启动子也就无法启动；如果在大肠杆菌中再引入一个带有T7噬菌体的溶菌酶编码基因的质 粒，如pLysS或pLysE,它们表达的T7溶菌酶可抑制T7 RNA聚合酶的活性，进一步防止 在未添加IPTG时T7启动子激活。利用组氨酸标签表达载体得到纯化的目的蛋白的原理。含有His标签的融合蛋白可与镍离子结合，将镍离子固定在树脂上，便可对融合蛋白进行亲 和层析分离。纯化的融合蛋白再用Xa因子切割，可切除组氨酸标签，从而获得目的蛋白。分泌表达载体与胞内表达载体的区别。将表达的蛋白分泌到细胞外或细胞周质区中，可避免细胞内蛋白酶的降解，或使表达的蛋白 正确折叠，或去除N-末端的甲硫氨酸，从
11、而达到维护目的蛋白活性的目的。包涵体的概念：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集 聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体。穿梭载体的概念：是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。碱裂解法提取质粒的原理。在 pH 高达 12.5 的碱性条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒 DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离； 当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型， 保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构；通过离心可除去
12、大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中， 再用酚/氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。Southern 杂交的流程。/ / /?/ / / /%/ /带有DNA片段的凝胶与放射性标记 DNA探针杂交吸附有DNA片段的膜Southern杂交、Northern杂交、Western杂交的异同。Southern杂交为DNA杂交，探针为DNA或RNA。检测DNA。Northern杂交为RNA杂交，探针为DNA或cDNA。原理、操作与Southern相似。Western杂交为蛋白质的免疫分析探针为抗体。Western杂交的总体过程与Southern杂交相 似。Northern 印迹与
13、 Southern 印迹的不同点1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和 电泳中不变性。2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理Southern印迹时，DNA转膜前 需进行碱变性及中和处理。3、靶核酸为RNA,不需限制酶消化。受体细胞：又称为宿主细胞或寄主细胞等，是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。感受态：细胞处于能够吸收DNA的状态，称为感受态。转化：质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的 过程称之为转化。氯化钙法转化大肠杆菌细胞的原理。细菌处于0C和低渗氯化钙溶液中，菌细胞壁和膜通透性增加，菌体膨胀成球形，
14、此时转化混 合物中DNA形成抗DNase羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经短暂热休克(42C)后，细 胞膜形成许多间隙，DNA进入细胞内DNA 芯片技术的概念： 是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸探针，或者直接将大量的DNA 探针以显微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂 交信号的检测分析即可得出样品的遗传信息。PCR 的原理、示意图。首先待扩增 DNA 模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引 物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下
15、的这种循环的不 断重复。5=目的基因_变性 I加热片.5二=_5聚合t底物5，5退火引物5,5 =聚合 I底物55，退火f引物5.=-55.55555变性与退火一延伸一变性与退火一延伸(重复)PCR 体系各成分的作用。 缓冲液：缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用 Mg2+ ，有时使用 Mn2+ 。dNTP： dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。 引物：在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1mM ，即 1pmol/ml 。浓度过高易导 致模板与引物错配,反应特异性下降。模板：模板的数量会直接影响扩增的效果。单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、 DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。DNA聚合酶：PCR反应中使用的DNA聚合酶是耐高温的，在90C以上的高温仍能有活性。 也正是高温DNA聚合酶的应用才使得PCR技术得以推广。Taq 酶与 Pfu 酶的异同。Tth DNA 聚合酶来自嗜热菌。 Pfu DNA 聚合酶来自激烈热球菌。Tth DNA 聚合酶可在高温下做 RT-PCR 、反转录和引物延伸反应， 避免
