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1、生物资源开发与利用专题双水相萃取技术及应用152310018 杨云梅双水相萃取（Aqueous two phase extraction，英文缩写ATPE）是利用物质 在互不相容的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。如：葡聚糖（dextran） 与聚乙二醇（PEG）按一定比例与水混合，溶液混浊，静置平衡后，分成互不相溶 的两相，上相富含PEG,下相富含葡聚糖。当两种聚合物或一种聚合物与一种盐 溶于同一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相容性，当聚合物或无 机盐浓度达到一定值时，就会分成不互溶的两相。因使用的溶剂是水，因此称为 双水相，在这两相中水分都占很大比例（85一95）,活性蛋
2、白或细胞在这种环 境中不会失活，但可以不同比例分配于两相,这就克服了有机溶剂萃取中蛋白容 易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点。双水相萃取的优点：1、操作条件温和，在常温常压下进行；不会引起生物活性物质的失活或变性。2、两相的界面张力小，萃取时两相能高度分散,传质速度快。3、排除了使用有毒、易燃的有机溶剂，能够提供温和的水环境，避免被萃取成 分的脱水变性。4、溶质对目标组分选择性强，大量杂质能与所有固形物一同除去，使分离操作5、过程简化，易于连续操作，处理量大，适合工业应用。缺点：系统易乳化，成相聚合物的成本较高，水溶性高聚物大多数粘度较大，不 易定量控制，高聚物回收困难。一：双水相萃取技
3、术的发展趋势目前，分离生物物质经常采用的双水相系统主要有 2 类：非离子型聚合物/ 水系统（最常用的为聚乙二醇/葡聚糖）和非离子型聚合物/无机盐/水系统（常 用的如聚乙二醇/盐体系）原因在于此2类双水相系统采用的是无毒性的聚合物， 且其多元醇、多元糖结构能够保证生物大分子的稳定性但在实际应用中，2 类双 水相系统各有弊端，非离子型聚合物/水系统能够保证生物活性物质的活性,且界 面吸附少，但所用聚合物材料如葡聚糖成本较大，且体系黏度大，制约大规模的 工业生产过程；相对于前者，非离子型聚合物/无机盐/水系统成本低，体系黏度 小，但该系统会导致某些敏感生物活性物质失活，此外还会产生大量的高浓度盐 废
4、水。因此，寻求新型双水相体系成为日后的主要研究方向。目前，新型双水相 体系的开发主要有廉价的双水相系统及其他新型功能双水相系统。（1）廉价双水相系统因为聚合物材料如葡聚糖等价格较高，目前寻找一些廉价的聚合物是廉价双 水相系统开发的主要方向，如采用变性淀粉、阿拉伯树胶等取代葡聚糖，羟基纤 维素取代聚乙二醇。王雯娟研究了采用羟丙基变性淀粉取代葡聚糖与PEG构成 双水相系统来萃取菠萝蛋白酶。（2）新型功能双水相系统 新型功能双水相系统是指系统中采用的聚合物易于回收或操作简便的双水 相体系。用乙烯基氧与丙烯基氧的共聚物（商品名UCON）和PET可以形成温敏性 双水相体系。常温条件下，PET, UCON
5、和水混合后均相体系，当温度加热到40 C时，形成两相体系，上相为PET和UCON，下相为水，这种体系可以实现PET 和UCON的循环利用。（3）以热分离聚合物和水组成的新型双水相体系（温度敏感型双水相体系）大多数水溶液热分离聚合物是环氧乙烷（EO）和环氧丙烷（PO）的随机共聚 物（简称EOPO聚合物），水-EOPO热分离两相体系由几乎纯水的上相和富含聚合 物的下相组成。如：Trit on和水形成的热分离双水相体系，当温度高于体系混 浊点时，表面活性剂和水形成双水相，上相为表面活性剂，下相为水。（4）正，负离子表面活性剂双水相体系 表面活性剂双水相体系是指采用表面活性剂为聚合物材料的双水相体系。
6、在一定浓度和混合比范围内、无任何外加物质的条件下，将阴离子表面活性剂十二 烷基硫酸钠和阳离子表面活性剂溴化十二烷基三乙铵进行混合，可以形成 2 个 互不混溶、平衡共存的水相，2相均为很稀的表面活性剂水溶液（其总质量分数 在 1%以下）。它具有含水量比较高，两相容易分离，表面活性剂的用量比较少， 目前，国内已有利用该系统分离蛋白质，酶，氨基酸等报告。（5）离子液体双水相系统的开发 离子液体是在室温或接近室温下以液体状态存在的有机熔融盐，完全由离子组成，有许多优点，如液体状态温度范围宽，具有良好的物理化学稳定性，几乎 没有蒸汽压，无可燃性，有良好的溶解性，具有溶剂和催化剂的双重功效。如用 C mi
7、nBF.NaHPO 双水相萃取青霉素。在最优化条件下萃取率达 93.7%，同4424时降低了青霉素的降解率。各种类型的双水相体系类型形成上相的聚合物形成下相的聚合物非离子型聚合物/非离 子型聚合物聚乙二醇葡聚糖聚乙烯醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮高分子电解质/非离子型 聚合物羧甲基纤维素钠聚乙二醇高分子电解质/高分子电 解质葡聚糖硫酸钠羧甲基纤维素钠聚合物/低分子量化合 物葡聚糖丙醇聚合物/无机盐聚乙二醇磷酸钾硫酸铵二：双水相萃取技术原理双水相系统形成的两相均是水溶液，它特别适用于生物大分子和细胞粒子的 分离。双水相萃取已逐渐应用于不同物质的分离纯化，如动植物细胞，微生物细 胞，病毒，叶绿体
8、，线绿体，细胞膜，蛋白质，核酸等。溶质在两水相间的分配 主要由其表面性质决定，通过在两相间的选择性分配而得到分离。分配能力的大 小可以用分配系数K表示K=C Ct/ bC C分别代表上相、下相中的溶质（分子或粒子）的浓度。研究表明，在 t， b相体系固定时，预分离物质在相当大的浓度范围内，分配系数K为常数，与溶质 的浓度无关，只取决于被分离物质本身的性质和特定的双水相体系的性质。根据2相平衡时化学位相等的原则，从Brownstedt方程式求得分配系数K,即InK 二兰MX式中M-物质分子量，入-系统表面特性系数，k-波尔兹曼常数，T-温度显 然因大分子物质的M值很大，入的微小改变会引起分配系数
9、很大的变化。因此利 用不同的表面性质（表面自由能），可以达到分离大分子物质的目的。双水相形成条件和定量关系常用三角形相图或直角坐标相图表示:图1是典型的高聚物-高聚物-水双水相体系的直角坐标相图,2种聚合物A、 B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成、密度的2相，轻相（上相）组成 用T点表示，重相（下相）组成用B点表示，由图1可知上下相所含高聚物有所偏 重，上相主要含B，下相主要含A, C点为临界点或褶点，表示两相差别消失。 曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。结线上方是2相区，下方为单相区。所 以组成在系线上的点，分为2相后，其上下相组成分别为T和B,T、B量的多少 服从相图的杠杆定律
10、。即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比 又由于2相密度相差很小（双水相体系上下相密度常在1.0-1.1kg/dm3之间）， 故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。性质差异：系线的 长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大；反之则越 小。三：影响双水相萃取的因素双水相萃取受许多因素的制约，被分配的物质与各种相组分之间存在着复杂 的相互作用，作用力包括氢键，电荷力，范德华力，疏水作用和构想效应。因此, 形成相系统的高聚物的相对分子质量和化学性质，被分配物质的大小和化学性质 都有直接的影响。粒子的表面暴露在外，与相组分相互接触，盐离子在两相间具
11、 有不同的亲和力，由此形成的道南电位对带电分子或粒子的分配具有很大影响。（1）聚和物的分子量的影响聚合物的分子量降低时，蛋白质易分配于富含该聚合物的相。例如在PEG DeX系统中，PEG的分子量减小，会使分配系数增大，而葡聚糖的分子量减小， 会使分配系数降低。这是一条普遍的规律，不论何种成相聚合物系统都适用。（2）成相聚和物浓度的影响当接近临界点时，蛋白质均匀地分配于两相，分配系数接近于1。如成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合物的总浓度增加时，系统远离临界 点，系线的长度也增加，此时两相性质的差别也增大，蛋白质趋向于向一侧分配, 即分配系数或增大超过1,或减小低于1。（3）体系中无机盐离子的影
12、响盐离子在两相中有不同的分配，因而在两相间形成电位差，由于各相要保持 电中性，因此对于带电荷的蛋白质等物质的萃取来说，盐的存在就会使系统的电 荷状态改变,从而对分配产生显著影响。盐的种类对双水相萃取也有一定的影响，因此变换盐的种类和添加其他种类 的盐有助于提高选择性。在不同的双水相体系中盐的作用也不相同。（4）体系PH的影响pH会影响蛋白质中可以离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分 配系数。pH也影响磷酸盐的解离程度，若改变H2P04-和HPO42-之间的比例，也 会使相间电位发生变化而影响分配系数。pH的微小变化有时会使蛋白质的分配 系数改变23个数量级。（5）体系温度的影响温度影响
13、较小，一般温度改变不影响产物的萃取。大规模操作一般在室温下 进行，不需冷却。这是基于：a.成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋白 质不会发生变性;b.常温下溶液粘度较低，容易相分离；c.常温操作节省冷却费 用.四：双水相萃取的应用（1）蛋白质、酶、多肽的纯化蛋白质、酶、多肽在这两相中水分都占很大比例（85% 95%）,因此称为 双水相。活性蛋白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同比例分配于两相， 这就克服了有机溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的缺 点。如在各种条件下，不同脱氢酶根据系数的不同而分离纯化。在一个聚乙二醇4000/葡萄糖T-500系统中，各种脱氢酶的分配
14、系数K与聚 乙二醇4000-NADH浓度的函数关系系统条件：7% （质量分数）聚乙二醇4000,6% （质量分数）葡萄糖T-500,0.05mol/L凝酸钾，PH值7.5，温度20C最佳。以蛋白质的分离为例说明双水相分离过程的原则流程：包括三步双水相分离：第一步：所选择的条件应使蛋白质产物分配在富PEG的上相中，而细胞碎片 及杂质蛋白质等进入下相。第二步：分相后上相中再加入盐使再次形成双水相体系，核酸和多糖则分配 入富盐的下相，杂质、蛋白质也进入下相，而所需的蛋白质再次进入富含PEG的上 相。第三步：向分相后的上相中加入盐以再一次形成双水相体系。在这一步中， 要使得蛋白质进入富盐的下相，以与大
15、量的PEG分开。蛋白质与盐及PEG的分离 可以用超滤、层析、离心等技术。细胞匀浆液+ FEG亍盐或眾繰）第一涉双抽目萃取1下相 纟毗碎片 杂蛋白、核鳞翅上相产品第二步眾朮相莘麻1下相1上相产品核藝或槍、杂還白第三步孜水相萃取静査分层卞栢产品上*目PEG杂蛋白、色素（2）中草药有效成分的提取中草药是我国的国宝，已有几千年的应用历史，但是有关中草药有效成分的 确定和提取技术在国内发展一直比较缓慢，这无疑限制了中药药理学的发展、深 化以及中药现代化。近几年来，有关双水相萃取技术提取中草药有效成分的文献 开始报道,尽管数量不多，但是已有的实例充分表明其有良好的应用前景。将PEG 和KHPO配成一定浓度的浓溶液；在常温下，取三七浓缩液置于10ml的离心试24管中，加入一定体积的成相物质浓溶液，振荡摇匀,在离心机中以一定转速离心 5min,使其分相；分别读取上下相体积，并取样分析上下相中三七总皂苷的含量。（3）黄毒苷的免疫测定基于液-液体系或界面性质而开发的分析检测技术是一项潜在的有应用价值 的生化检测分析技术。这一技术已成功地应用于免疫分析、生物分子间相互作用力的测定和细胞数的测定。如强心药物异羟基毛地黄毒苷(简称黄毒苷)的免疫 测定。双水相体系检测螺旋霉
