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1、三代基因组测序技术原理简介摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）】，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了 相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势 看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍 然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技 术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研 究，药物研发， 育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序 原理做一个简单的小结。图1：测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1
2、）所描述的是自 沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是 1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）.并在1977 年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探 生命遗传差异本质 的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之 中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其
3、测序 基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2和3都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形 成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带 有放射性同位素标记的ddNTP （分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影 后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为sanger测序法制作了一个 小短片，形象而生动。值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了 Sanger法之外还出现了一些其他的测序 技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454
4、技术所使用的测 序方法2-4,而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段 都是利用了 Sanger】中的可中断DNA合成反应的dNTP。Dr. Fred SangerFrederick Sa/gw wras awarded the prize w both 1955 rntf J 980. Hets the jtourth persoiT 命 the wwM 构 have ifeert做创总血 hvo 隔b凶 Prizes and “总 da也 pmm to receive bof 打 in chemistry.*did-eo)cyn sequenc
5、ing technlc|u电 Sanger et al.P 1977*ONA就脱範糙貨止i上测序图2： Sanger法测序原理第二代测序技术oB0Tofi於 y1 1 1 1 .1asnj Eocoo 唇 ltAQuFirst GenerationSequencingi i i*Seco nd GenerBtiun SequencingiiiiIIiIi |i ii I总的说来，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达lOOObp，准确性高达99.999%，但其测序成 本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真 正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最理想 的测序方法。经过不断的技术开发和改进，
6、以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa， Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了 测序成本的同时，还大幅提高了测序速 度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序 需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要 短很 多。表1和图3对第一代和第二代测序技术各自的特点以及测序成本作了一个简单的比较5， 以下我将对这三种主要的第二代测序技术的主要原理和特点作一个简单的介绍。图3. 测序成本的变化1. IllumineIllumina公司的Solexa和Hiseq应该说
7、是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个 系列的技术核心原理是相同的2,。4 这两个系列的机器采用的都是边合成边测序的方法，它 的测序过程主要分为以下4步，如图4.（1）DNA待测文库构建利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，目前除了组装之外和一些其他的特殊要求之 夕卜，主要是打断成200-500bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头， 构建出单链DNA文库。（2）FlowcellFlowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，当文库建好后，这些文库中的DNA在通过 flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。每个Flowcell有8个 c
8、hannel，每个channel的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段 两端的接头相互配对（这就是为什么flowcell能吸附建库后的DNA的原因），并能支持 DNA在其 表面进行桥式PCR的扩增。（3）桥式PCR扩增与变性桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增，如图4.a所示。经过不 断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有 单个DNA模板的很多分拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达 到测序所需的信号要求。4）测序测序方法采用边合成边测序的方法。向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引
9、物和带有 碱基特异 荧光标记的4中dNTP （如同Sanger测序法）。这些dNTP的3 -OH被化学方法 所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成 链上后，所有未使用的游离 dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信 号，并有光学设备完成荧光信号的记录， 最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱 基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3 -OH保护基 团，以便能进行下一轮的测序反应Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点 能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问 题，它的主要测序错误
10、来源是碱基的替换，目 前它的测序错误率在1 %-1.5%之间，测序周期以人类基因组重测序为例，30x测序深度大约 为1周。AdaptsPrspkar# genonnic DNAiampI# 肪 rnJontyfl翊 EfnTgerflmk DNA and li护诧 sdapters to both endi of rhe frig meniEArstchenistry cycle: determine first baseTo inlilaie tliefirsi sequencing cycl. add all four a be led reversible tenriinatDrs, p
11、rimeisland CNA polymerase enzyme to theflDWll.Image of first chemistry cycleAfter laserCKEitatiory capture the image 卅 emittec fluorescence from ecteh cluster on the flow cell. Rjecord the ident itv of the first base fc r each cluster.Sequence read over multiple chemistry cyclesRepeat cycles of sequ
12、encin to determine the st?qUEnteof basesin a given fragment j single base at j time, http: /blog. esdn. net/dyllove98Before initiating the next chemistry cycleThe blockcc 3 tcrminijs and te fluoro phone from each Incarperatec base arer&ijed.图4. Illumina测序流程1. Roche 454Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台
13、。它的主要测序原理是（图5 abc）2：（1）DNA文库制备454测序系统的文件构建方式和illumina的不同，它是利用喷雾法将待测DNA打断成300- 800bp长的小片段，并在片段两端加上不同的接头，或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR 扩增，连接载体，构建单链DNA文库（图5a）。（2）Emulsion PCR （乳液PCR，其实是一个注水到油的独特过程）454当然DNA扩增过程也和订lumina的截然不同，它将这些单链DNA结合在水油包被的直 径约28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注 水 到
14、油”（水包油），基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高 速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水 滴。这些小水滴就构成了独 立的PCR反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个磁珠。这些被小水滴包被的磁珠表面含有与接头互补的DNA序列，因此这些单链DNA序列能够特异地 结 合在磁珠上。同时孵育体系中含有 PCR 反应试剂，所以保证了每个与磁珠结合的小片段都能 独立进行 PCR 扩增，并且扩增产物仍可以结合到磁珠上。当反应完成 后，可以破坏孵育体系并 将带有DNA的磁珠富集下来。进过扩增，每个小片段都将被扩增约100万倍，从而达到下一步
15、 测序所要求的 DNA 量。（3）焦磷酸测序测序前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋白处理带有 DNA 的磁珠，接着将磁珠放在一种 PTP 平 板上。这种平板上特制有许多直径约为 44um 的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方 法来固定每个磁珠的位置，以便检测接下来的测序反应过程。DNA library preparationJi45 hoursLigationSelection(hdate AB fragmentsnl/igDNA测序方法采用焦磷酸测序法，将一种比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中，启动测序反 应。测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反 应。如果dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。释放的焦磷酸基团会与反 应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成ATP。生成的ATP和荧光素酶共同氧化使测序反应中的荧 光素分子并发出荧光，同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录，最后通过计算机进行光信号处 理而获得最终的测序结果。由于每一种 dNTP 在反应中产生的荧光颜色不同，因此可以根据荧光 的颜色来 判断被测分子的序
