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1、实验报告一 实验目的质粒提取即将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。本次实验的目的重要是获得相对纯净的植物表达载体质粒E1-PUC18二 实验内容1. 理解质粒提取的基本原理2. 熟悉质粒提取的基本操作环节3. 获得相对纯净的目的质粒三 实验原理1. Buffer P1（重悬菌体，提供缓冲环境） 重要成分是50 mmol/L葡萄糖，25 mM/L Tris-HCl，10 mM/L EDTA，pH8.0重要作用：悬浮菌体葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到离心管的底部；EDTA克制DNase的活性，2. Buffer P2（氢氧化钠和SDS裂解菌体细胞
2、壁、在细胞膜上穿孔，释放细胞内的质粒）重要成分是0.2mol/L的NaOH ，1% SDS重要作用是破坏细胞壁和细胞膜，使细胞的内容物释放其中NaOH重要是为了溶解细胞，释放DNA，由于在强碱性的情况下，细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜。注意事项：第一，时间不能过长，由于在这样的碱性条件下基因组DNA片断也会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。破细胞的重要是碱，而不是SDS，所以称为碱法抽提。3.Buffer P3（中和氢氧化钠、SDS中的钠被钾替换，吸附菌体产生沉淀）
3、重要成分是3mol/L的醋酸钾，2mol/L 醋酸，75%酒精重要作用是沉淀蛋白和中和反映其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS，由于十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）碰到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。2 mol/L的醋酸是为了中和NaOH。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50100 kb大小的片断，就没有办法再被 PDS共沉淀了，所以碱解决的时间要短，并且不得剧
4、烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观测到一条较亮的总DNA条带。75%酒精重要是为了清洗盐分和克制DNase；同时Buffer P3的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上3. Buffer DW1重要成分为去蛋白液，可以进一步减少蛋白残留量4. Wash Solution重要成分为80%的乙醇重要是起到洗涤的作用，使质粒DNA纯化和沉淀5. Elution Buffer重要成分是pH=8.0的TE缓冲液重要作用是最后把DNA从柱子上洗脱下来四 实验器材SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司小型高速离心机，1.
5、5ml离心管，无水乙醇等五 实验环节菌体收集裂解上柱洗涤洗脱1. 准备工作检查Buffer P1中是否已加入RNase A（储存于2-8，有效期为6个月）检查Wash Solution中是否已经加入乙醇（乙醇终浓度为80%，室温密封保存）检查Buffer P2和P3中是否出现沉淀（如有沉淀，于37溶解沉淀，待冷却至室温后使用）2. 取4ml过夜培养（37摇床振荡培养14h）的E1-PUC18菌液（分装于4个1.5ml的EP管中）12023g离心10分钟收集菌体，弃尽培养基3. 在沉淀中加入250l Buffer P1，彻底悬浮菌体4. 加入250l Buffer P2，立即温和颠倒离心管10次
6、（两手来回颠倒），然后室温静置4分钟（开盖后有拉丝的现象，说明效果较好）5. 加入350l Buffer P3，立即温和颠倒离心管5次混匀（将离心管在试管架上翻转过来左右摇摆5次）6. 12023g离心10分钟，将上清液移入吸附柱（只能装750l，应多次离心），9000g离心30秒，倒掉收集管中液体7. （选做）加入500l Buffer DW1,9000g离心30秒，倒掉收集管中液体8. 加入500l Wash Solution，9000g离心30秒，倒掉收集管中液体9. 反复环节8一次10. 空吸附柱于9000g离心1分钟11. 将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入65l Elution Buffer（60预热），室温静置一分钟后，离心1分钟，保存管中DNA溶液（-20）六 结果分析与讨论琼脂糖凝胶电泳结果显示质粒浓度偏小，未有明显条带。因素也许有1. 菌液浓度太低2. 质粒提取操作某些细节也许存在问题
