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1、实验十、发酵过程中的还原糖测定实验目的1、学习和掌握发酵过程中的取样操作。2、了解还原糖的各种测定方法；掌握DNS法测定的操作方法及注意事项。3、了解青霉素发酵过程中还原糖对发酵效价的影响。实验原理（一）发酵过程中的取样操作取样操作是发酵过程中在线控制的重要内容；只有通过取样才能对发酵过程中的诸多参数进行测定，以求进一步的控制。操作要注意动作协调、快速，不能造成发酵罐的污染，严格按照相应程序进行。盛放样品的器皿也要洁净、无菌，以防止对测定结果产生影响。（二）发酵过程中的还原糖测定单糖和某些寡糖含有游离的醛基或酮基，有还原性，属于还原糖。而多糖和蔗糖等属于非还原性糖；利用多糖能被酸水解为单糖的性
2、质可以通过测定水解后的单糖含量对总糖进行测定。青霉素的发醇工艺是通过一系列工艺参数来实现的。这些参数中包括物理参数，即温度、压力等。二是化学控制系数，即pH、糖的浓度等；其中糖的浓度是控制发酵过程中的重要参数之一。由于碳源对于发酵过程菌体生长及青霉素合成都有较大影响。因此，测知发酵过程中还原糖浓度变化，对青霉素发酵控制有重要的指导意义。还原糖的测定方法有很多，一般有菲林试剂法、酶法和DNS法。A、菲林试剂法菲林试剂由质量浓度为0.1g/mL的NaOH溶液和质量浓度为0.05g/mL的CuSO4溶液配制而成，二者混合后，立即生成淡蓝色的Cu(OH)2沉淀。Cu(OH)2在加热条件下与醛基反应，被
3、还原成砖红色的Cu2O沉淀，醛基则被氧化为羧基。利用菲林溶液与还原糖共沸，生成氧化亚铜沉淀的反应，以次甲基蓝为指示液，以样品或经水解后的样品滴定煮沸的菲林溶液，达到终点时，稍微过量的还原糖将蓝色的次甲基沉还原为无色，以示终点。根据样品消耗量求得总糖或还原糖的含量。用菲林试剂鉴定可溶性还原糖时，溶液的颜色变化过程为：浅蓝色棕色砖红色(沉淀)。B、酶法又称葡萄糖氧化酶过氧化物酶法。葡萄糖氧化酶可将葡萄糖氧化成葡萄糖酸并产生过氧化氢，后者与苯酚及安替比林在过氧化物酶作用下生成红色化合物，葡萄糖的浓度与红色深浅成一定比例。一般可采用葡萄糖测定的试剂盒，测定方法简单、快速C、DNS法又称3，5二硝基水杨
4、酸法。在碱性溶液中，还原糖变为烯二醇，烯二醇可被3，5二硝基水杨酸氧化为糖酸。加热进一步产生一种棕红色的氨基化合物。在一定浓度范围内，还原糖的量与棕红色物质的深浅成一定比例关系，通过此比例测定还原糖的含量。三种方法各有不同的应用和使用范围，应根据具体情况选择。例如菲林法容易受青霉素效价及其他还原性物质的干扰且滴定终点不易判断，误差较大；酶法专一性强且结果准确，但成本较高，适宜精确测定；而DNS法则结果准确且操作相对简单；在生产和研究中应用相对更为广泛。实验材料1、分析试剂DNS显色剂 每1000mlDNS溶液含有酒石酸钾钠 182g，无水亚硫酸钠 3g，氢氧化钠 20g，3，5二硝基水杨酸 6
5、.3g，重蒸馏酚 4g。配后过滤放置半月后使用。1%葡萄糖标准溶液：准确称取100mg葡萄糖，用少量蒸馏水溶解后定容至100ml，冰箱保存备用.10%ZnSO4溶液. 2、器材 分光光度计，定糖管，移液管，容量瓶，烧杯，电炉等。方法步骤 （一）葡萄糖标准曲线的绘制取9只定糖管（有盖子，且用绳子系住），分别按照下表1的顺序加入各种试剂，沸水浴中加热5min，后立即流动水冷却。管内溶液混匀， 用空白管溶液调零点，520nm测定光密度值(O.D.)，以葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标绘制葡萄糖溶液标准曲线。表1 制作葡萄糖标准曲线时各试剂用量项目CK12345678含糖总量(mg)00.20.4
6、0.60.81.01.21.41.6葡萄糖液(ml)00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸馏水(ml)2.01.81.61.41.21.00.80.60.4DNS试剂(m1)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5加热均在沸水浴中加热5min冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水(ml)21.521.521.521.521.521.521.521.521.5光密度(520nm)（二）青霉素发酵液的制备按照发酵罐取样的操作规程取样，并用洁净的三角瓶盛放。（三）青霉素发酵液的制备取一定体积的青霉素发酵液在12000rpm下离心10min去除产黄青霉菌丝体。准确量取5ml发酵上清液
7、（视含糖量高低而定，在发酵周期内不同时期取样数量应有所不同）于100ml容量瓶中，加入10ml 10%ZnSO4溶液，用碱液（NaOH 3mol/L）调节显碱性，以水稀释至刻度、摇匀；通过干燥滤纸过滤。按照表2加入相应试剂进行反应。520nm测定光密度值，最后根据葡萄糖标准曲线算出发酵液所含还原糖的量。每管测定三次，求平均值。表2 青霉素发酵液所含还原糖的测定项目CK123发酵液(ml)00.80.80.8蒸馏水(ml)2.01.21.21.2DNS试剂(m1)1.51.51.51.5加热均在沸水浴中加热5min冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水(ml)21.521.521.521.5光密度(520
8、nm)注意：1、实验中所有的试管要干净，加入各种试剂量要准确。2、试剂不可倒出试剂瓶，用干净的移液管吸取，用后盖好瓶塞，防回原处。3、定糖管的管口在加热时不可朝向人，以免糖液过度沸腾飞溅伤人。4、葡萄糖标准曲线绘制要准确，尽量符合统计学意义（R297）。如果绘制时浓度过度分散需重做依次。5、分光光度计使用：溶液不要倒太多；毛边不要对着透光处；用后用自来水冲洗干净，防回原处。 实验结果1、 填写表1，并绘制葡萄糖标准曲线图。 项目CK12345678含糖总量(mg)00.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖液(ml)00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸馏水(ml)2
9、.01.81.61.41.21.00.80.60.4DNS试剂(m1)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5加热均在沸水浴中加热5min冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水(ml)21.521.521.521.521.521.521.521.521.5光密度(520nm)0-0.0120.0320.0670.1090.2030.1760.3620.342、 根据葡萄糖标准曲线，算出发酵液中还原糖的浓度。经过24h发酵后侧得发酵液的吸光值项目CK123发酵液(ml)00.80.80.8蒸馏水(ml)2.01.21.21.2DNS试剂(m1)1.51.51.51.5加热均在沸水浴中加热5m
10、in冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水(ml)21.521.521.521.5光密度(520nm)00.6840.5130.626光密度平均值0.608葡萄糖含量标准曲线为：y=0.054x 0.0833测定葡萄糖的含量 x=(y+0.0833)/0.054=（0.608+0.0833）/0.054=22.852 mg发酵液中还原糖浓度C=（22.852/0.8）100/5=571.3mg/ml思考题1、测定青霉素发酵液的还原糖浓度时，为什么要预先将发酵液中的菌丝体离心分离掉？如果不分离，对测定结果可能会有什么影响？ 答：本试验是运用测定吸光度值，根据标准曲线来计算溶液中对应物质的含量的，若发酵液中存在菌丝体会影响吸光度值的测定，造成计算的葡萄糖含量不准确。若不分离，发酵液的吸光度值会偏大，计算得到的发酵液中还原糖浓度比实际大。
