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1、厌氧性细菌的分别培育法厌氧菌需有较低的氧化复原势能才能生长(比如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化复原电势降低至0.11V时才开始生长)，在有氧的环境下，培育基的氧化复原电势较高，不适于厌氧菌的生长。为使培育基降低势，降低培育环境的氧压是十分必需的。现有的厌氧培育法甚多，主要有生物学，化学和物理学3种方法，可依据各实验室的详细状况而采纳。1生物学方法培育基中含有植物组织(如马铃薯、燕麦、抽芽谷物等)或动物组织(新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等)，因为组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而耗费氧气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能耗费氧气，碎肉培育基的应用，就是依据这个原理)，组织中所含
2、的复原性化合物如谷胱甘肽也能够使氧化复原电势降落。此外，将厌氧菌与需氧菌共同培育在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧耗费后，使厌氧菌能生长。其方法是将培育皿的一半接种汲取氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌)，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用白腊密封，置37恒温箱中培育23d后，即可察看到需氧菌和厌氧菌均先后生长。2化学方法利用复原作用强的化学物质，将环境或培育基内的氧气汲取，或用复原氧化型物质，降低氧化复原电势。此法系用连二亚硫酸纳(Sodiumhydrosulphite)和碳酸钠以汲取空气中的氧气，其反响式如下：Na2S204十Na2C03十O2一Na2SO4十Na2SO3十
3、C02取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内直立于罐内)，最上端保存可容纳12个平皿的空间(视玻罐的体积而定(如系液体培育基，则)，按玻罐的体积每1000cm3空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各30g，在纸上混匀后，混淆物湿润，但不行过湿，免得罐内水分过多。若用无盖玻罐，以无盖玻罐罩于皿上，罐口四周用胶泥或水银关闭(如图盛于上边的空平皿中，加水少量使则可将平皿重叠正放在浅底容器上，)。（）焦性没食子酸法焦性没食子酸在碱性溶液中能汲取大重氧气，同时由淡棕变成深棕色的焦性没食橙(Purpurgallin)。每l00cm3空间用焦性没食子酸1g及10氢氧化纳或氢氧化钾l0ml，其
4、详细方法主要有以下几种：1）单个培育皿法：将厌氧菌接种于血琼脂平板。取方形玻璃板一块，中央置纱布或棉花或重叠滤纸一片，在其上放焦性没食子酸0.2g及10NaOH溶液0.5mL。快速拿去皿盖，将培育皿倒置于其上，四周以消融白腊或胶泥密封。将此玻璃板连同培育皿放人37C温箱培育2448h后，拿出察看。2）Buchner氏试管法：取一大试管，在管底放焦性没食子酸0.5g及玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝。将已接种的培育管放人大试管中，快速加入20NaOH溶液0.5ml，立刻将管口用橡皮塞塞紧，必需时四周封以白腊，37培育2448h后察看(图)。）玻罐或干燥器法：置适当焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下边
5、，将培育皿或试管置于隔板上，并在玻罐内置美蓝指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶液放于罐底，将焦性没食子酸用纸或纱布包好，用线系住，暂勿与氢氧化钠接触，待全部准备好后将线放下，使焦性没食子酸落人氢氧化纳溶液中，立刻将盖盖好；封紧，置温箱中培育。）瑞(Wright)氏法：将已接种细菌的培育管的脱脂棉塞在火焰中炙烤灭菌后，塞人管中离培育基115cm处，置适当焦性没食子酸于其上，加入10NaOH溶液2ml，快速用橡皮塞将管口塞紧，以胶泥或白腊严实关闭置温箱中培育(图)。）史(Spray)氏法：用图所示的厌氧培育皿，在皿底一边置焦性没食子酸，另一边置氢氧化钠溶液，将已接种的平皿翻盖于皿上，并将接合处用胶泥
6、或白腊密封完整，而后摇动底部，使氢氧化钠溶液与焦性没食子酸混淆，置温箱中培育。）平皿法：置一片中有小圆孔的金属板于两平皿之间，上边的平皿接种细菌，下边的平皿盛焦性没食子酸及氢氧化钠溶液，用胶泥封固后，置温箱中培育（图）。）硫乙醇酸钠法硫乙醇酸钠(HSCH2COONa)是一种复原剂，加入培育基中，能除掉此中的氧或复原性物质，促进厌氧菌生长。其余可用的复原剂包含葡萄糖、维生素C、半胱氨酸等。A 液体培育基法：将细菌种人含0.1的硫乙醇酸钠液体培育基中，37培育2448h后察看，本培育基中加美蓝液作为氧化复原的指示剂，在无氧条件下，美蓝被复原成无色。固体培育基法：常采纳特别结构的过程是先将Brewe
7、rBrewer培育皿，可使厌氧菌在培育基表面生长而形成孤立的菌落；氏皿干热灭菌，将熔解且冷却至50左右的硫乙醇酸钠固体培育基倾人操作皿内。待琼脂冷凝后，将厌氧菌接种于培育基的中央部分。盖上皿盖，使皿盖内缘与培育基外头部分互相密切接触（图10)。此时皿盖与培育基中央部分留在缝隙间的少量氧气可被培育基中的硫乙醇酸钠复原，故美蓝应渐渐退色，而外缘部分，因与大气相通，故仍呈蓝色。将Brewer氏培育皿置于37恒温箱内，经过2448h后察看。3物理学方法利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱除或隔断环境及培育基中的氧气，使其形成厌氧状态，有益于厌氧菌的生长发育。（）厌氧罐法常用的厌氧罐有Brewer氏罐
8、，Broen氏罐和Mclntosh-Fildes二氏罐（图11）。将接种好的厌氧菌培育皿挨次放于厌氧罐中，先抽去部分空气，代以氢气至大气压。通电，使罐中残余的氧与氢经铂或钯的催化而化合成水，使罐内氧气所有消逝。将整个厌氧罐放人孵育箱培育。本法合用大批的厌氧菌培育。（）真空干燥器法将欲培育的平皿或试管放人真空干燥器中，开动抽气机，抽至高度真空后，代替以氢、氮或二氧化碳气体。将整个干燥器放进孵育箱培育。（）高层琼脂法加热消融高层琼脂，冷至45左右接种厌氧菌，快速混淆平均。冷凝后37培育，厌氧菌在近管底处生长。（）加热密封法将液体培育基放在阿诺氏蒸锅内加热l0min，驱除溶解于液体中的空气，拿出，快速置于冷水中冷却。接种厌氧菌后，在培育基液面覆盖一层约0.5cm的无菌凡士林白腊，置37培育。别的，另有摇振培育法，此处从略。（）二氧化碳培育法少量细菌如布氏杆菌(牛型)等，孵育时，需大气中增添510二氧化碳，方能使之生长生殖旺盛。常用的方法是置于CO2培育箱中进行培育；最简单的二氧化碳培育法是在盛放培育物的有盖玻璃缸内，燃点蜡烛，当火焰熄灭时，该缸的大气中，就约增添了510的二氧化碳。也可用化学物质作用后生成二氧化碳，如碳酸氢钠与硫酸钠或碳酸氢钠与硫酸作用即可生成二氧化碳。若各用0.4NaHCO3与30H2SO4lmL，则可产生22.4mL的二氧化碳气体。
